Tüm hayvan modeli prosedürleri, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Hayvan bağışıklaması
- Deri altı (s.c), 6-8 haftalık dişi BALB / c farelerine, her 2 haftada bir adjuvanlarla karıştırılmış 50 μg APN proteini veya fosfat tamponlu salin (PBS, negatif kontrol) enjekte eder. İlk bağışıklama için ısıyla öldürülmüş Mikobakterileri içeren tam Freund adjuvanını ve güçlendirici aşılamalar için eksik Freund adjuvanını kullanın. Sırasıyla eşit hacimlerde APN proteini (veya PBS) ve Freund'un adjuvanını veya eksik Freund'un adjuvanını karıştırın.
- 0.05 M PBS (pH 9.6) içinde seyreltilmiş 5 μg / mL APN proteini ile kaplanmış bir mikrotitre plakası kullanarak dolaylı enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile bu farelerin serumlarında APN'ye karşı antikor titrelerini tespit edin.
2. APN'ye karşı monoklonal antikorlar üretmek için hibridoma teknolojisi
- İntraperitoneal olarak (ip), son bir antijen artışı için seçilen farelere 100 μg APN proteini enjekte edin.
- Üç gün sonra, pentobarbital sodyum (50 mg / kg, v / v, intraperitoneal) ve servikal çıkık kullanarak farelere ötenazi yapın.
- Dalakları toplayın ve kan ve yağ hücrelerini çıkarmak için iki kez DMEM ile yıkayın. Doku kalıntılarını gidermek için 200 gözenekli bir bakır ızgara kullanarak dalak hücresi süspansiyonunu filtreleyin ve dalak zarını çıkarmak için santrifüjleme (1500 × g, 10 dakika) kullanarak dalak hücrelerini hasat edin.
- Hücre canlılığını korumak için %6 fetal sığır serumu (FBS) ve 37 °C, %6CO2 atmosferinde kültür ile desteklenmiş 5 mL Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyeri (DMEM) içeren 25 cm'lik 2 şişede tohum fare miyelom SP2/0 hücreleri. 5-6 günlük kültürden sonra, hücreler resüsitasyon sonrası% 80 -% 90 birleşmeye ulaşır ve büyüme günlüğü aşamasındadır. Mikroskop altında hücreler yuvarlak, parlak ve berraktır.
- Hibridizasyondan bir gün önce, daha önce yayınlanmış bir yönteme göre farelerin periton boşluklarından makrofajları toplayın.
- Her biri 100 μL HAT ortamı (% 10 FBS ve 1x HAT Takviyesi ile desteklenmiş DMEM) içeren 96 oyuklu plakalarda 0.1-0.2 × 105 / mL yoğunlukta tohum peritoneal makrofajlar ve gece boyunca 37 ° C,% 6 CO2 nemlendirilmiş atmosferde inkübe edin.
- Hibridizasyon için, SP2 / 0 hücrelerini 8-10 şişeden bir pipetle nazikçe aspire edin ve 10 mL serumsuz DMEM ortamında askıya alın. Hücreleri taze DMEM ile yıkayın, iki kez santrifüjleyin (1500 × g, 10 dakika) ve ardından 10 mL DMEM'de yeniden süspanse edin.
- Niceliksel dalak hücrelerini SP2/0 hücreleri ile 10:1 oranında karıştırın ve 50 mL'lik tüplere aktarın. Santrifüjleyin (1500 × g, 10 dakika) ve süpernatanı atın. Hücre peletlerini tüplerin altında toplayın ve hibridizasyondan önce peletleri gevşetmek için avuç içi ile hafifçe vurun.
- Önceden 37 °C'ye ısıtılmış 1 mL polietilen glikol 1500 (PEG 1500) ekleyin, tüpün tabanını hafifçe döndürürken 45 s süre boyunca gevşetilmiş hücre peletine bir damlalık kullanarak damla damla ekleyin.
- Yukarıdaki karışıma 90 s boyunca 37 ° C'ye önceden ısıtılmış 1 mL DMEM'i yavaşça ekleyin, ardından 30 mL daha taze DMEM ekleyin. Füzyon tüpünü 30 dakika boyunca 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
- Ilık banyoda inkübasyondan sonra, hücreleri hasat edin ve HAT ortamında tekrar süspanse edin. Daha sonra peritoneal makrofajlarla aşılanmış 96 oyuklu bir plakada kültür.
- Beş gün sonra, her bir oyuğa 100 μL taze HAT ortamı ekleyin ve plakayı 5 gün daha inkübe edin, ardından ortamı HT ortamı ile değiştirin (% 10 FBS ve 1x HT Takviyesi ile desteklenmiş DMEM).
- ELISA testi kullanılarak hibridoma süpernatantındaki monoklonal antikorları analiz etmek için 0.05 M PBS (pH 9.6) ile seyreltilmiş 5 μg/mL APN proteini ile kaplanmış bir mikrotitre plakası kullanın.
- 96 oyuklu plakanın oyuklarındaki ortam sarardığında (hücre büyümesi ve metabolit salınımı nedeniyle, ortamdaki pH 6.8'e düşer ve fenol kırmızısı fuşyadan sarıya döner) veya hücre kümeleri gözlendiğinde, seçilen oyuklardan 100 μL süpernatant alın ve kaplanmış ELISA plakasının kuyucuklarına ekleyin. OD450 değerlerini ölçmek için bir mikroplaka okuyucu kullanın.
- APN'ye ve enfekte olmayan fare serumuna karşı poliklonal antikorları sırasıyla pozitif ve negatif kontrol olarak kullanın ve PBS'yi boş kontrol olarak kullanın. Bu çalışmada, numunenin OD450 negatif kontrole oranı (P/N) ≥ 2.1 pozitif seçim standardı olarak kabul edilmiştir.
