1. Domuz aminopeptidaz N (APN) protein antijeninin hazırlanması
>NOT: pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) suşu ve APN kararlı bir şekilde eksprese edilen hücreler pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 önceki bir çalışmada oluşturulmuştur.
- Donmuş bir gliserol stoğundan bakterileri geri kazanın ve tek koloni izolasyonu için 50 μg / mL kanamisin (Km +) içeren Luria-Bertani (LB) plakalarına çizin.
- Taze çizgili plakadan tek bir koloni seçin, 4 mL LB ortamında (10 g/L tripton, 10 g/L sodyum klorür (NaCl) ve 5 g/L maya özütü, pH 7.2) ile kültürleyin, Km+ (50 μg/mL) ile desteklenmiş ve 37 ° C'de çalkalama (178 rpm) ile gece boyunca (12-16 saat) büyümeye bırakın.
- Hazırlanan bakterileri taze Km+ LB suyunda 1:100'de seyreltin ve OD600 0.4-0.6'ya ulaşana kadar 2-3 saat çalkalayarak 37 °C'de inkübe edin.
- Ortama 0.4 mM'lik bir nihai konsantrasyona kadar izopropil β-d-1-tiyokalaktopiranosit (IPTG) ekleyin ve kültürleri 16 ° C'de 10 saat daha inkübe edin.
- Sonuç olarak, IPTG indüksiyonu (10.000 × g, 4 °C 15 dakika) kullanarak bakterileri santrifüjleyin ve hasat edin.
- 1 mg / mL lizozim içeren 5 mL LEW (Lizis / Dengeleme / Yıkama) tamponu (50 mM susuz sodyum fosfat monobazik (NaH2PO4) ve 300 mM NaCl, pH 8.0) kullanarak hücre peletini yeniden süspanse edin. Bakteriyel süspansiyonu buz üzerinde 30 dakika karıştırın ve ultrasonik bir homojenizatör kullanarak tamamen sonikasyon yapın (15 s darbe ve 20 s kapalı, 15 dakika).
- Hücresel kalıntıları gidermek için ham hücre lizatını 4 ° C ve 10.000 × g'da 30 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı önceden dengelenmiş bir kolona aktarın ve yerçekimi drenajından 1-2 dakika önce inkübe edin. Bu adımı üç kez tekrarlayın.
- Kolonu 20 mL LEW tamponu kullanarak yıkayın ve yerçekimi kullanarak boşaltın. 9 mL elüsyon tamponu (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl ve 250 mM imidazol, pH 8.0) kullanarak histidin etiketli APN proteinini elute edin ve diyaliz tüpüne toplayın.
- Protein çözeltisini sodyum karbonat-sodyum bikarbonat (fosfat tamponlu salin (PBS), 135 mM NaCl, 4.7 mM potasyum klorür, 2 mM NaH2PO4 ve 10 mM dodekahidrat sodyum fosfat dibazik, pH 7.2) tamponunda 4 ° C'de gece boyunca diyalize edin.
- APN proteininin saflığını değerlendirmek için %12.0 SDS-PAGE jel ve western blotting kullanarak analiz edin.
- Jelin her bir oyuğuna 5 μg protein yükleyin ve 1.5 saat boyunca 110 V'ta çalışmasına izin verin. Daha sonra, proteini 15 V'ta 50 dakika boyunca bir poliviniliden florür (PVDF) membranına aktarın. Bir bikinkoninik asit (BCA) testi kullanarak saflaştırılmış proteinin konsantrasyonunu belirleyin.
2. Hayvan bağışıklaması
- Deri altı (s.c), 6-8 haftalık dişi BALB/c farelerine her 2 haftada bir adjuvanlarla karıştırılmış 50 μg APN proteini veya PBS (negatif kontrol) enjekte eder. İlk bağışıklama için ısıyla öldürülmüş Mikobakterileri içeren tam Freund adjuvanını ve güçlendirici aşılamalar için eksik Freund adjuvanını kullanın. Sırasıyla eşit hacimlerde APN proteini (veya PBS) ve Freund'un adjuvanını veya eksik Freund'un adjuvanını karıştırın.
- 0.05 M PBS (pH 9.6) içinde seyreltilmiş 5 μg / mL APN proteini ile kaplanmış bir mikrotitre plakası kullanarak dolaylı enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile bu farelerin serumlarında APN'ye karşı antikor titrelerini tespit edin.
3. APN'ye karşı monoklonal antikorlar üretmek için hibridoma teknolojisi
- İntraperitoneal olarak (ip), son bir antijen artışı için seçilen farelere 100 μg APN proteini enjekte edin.
- Üç gün sonra, pentobarbital sodyum (50 mg / kg, v / v, intraperitoneal) ve servikal çıkık kullanarak farelere ötenazi yapın.
- Dalakları toplayın ve kan ve yağ hücrelerini çıkarmak için Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ile iki kez yıkayın. Doku kalıntılarını gidermek için 200 gözenekli bir bakır ızgara kullanarak dalak hücresi süspansiyonunu filtreleyin ve dalak zarını çıkarmak için santrifüjleme (1500 × g, 10 dakika) kullanarak dalak hücrelerini hasat edin.
- Hücre canlılığını korumak için %6 fetal sığır serumu (FBS) ve 37 °C, %6 karbondioksit (CO2) atmosferinde kültür ile desteklenmiş 5 mL DMEM içeren 25 cm'lik 2 şişede tohum fare miyelom SP2/0 hücreleri. 5-6 günlük kültürden sonra, hücreler resüsitasyon sonrası% 80 -% 90 birleşmeye ulaşır ve büyüme günlüğü aşamasındadır. Mikroskop altında hücreler yuvarlak, parlak ve berraktır.
- Hibridizasyondan bir gün önce, daha önce yayınlanmış bir yönteme göre farelerin periton boşluklarından makrofajları toplayın.
- Her biri 100 μL hipoksantin-aminopterin-timidin (HAT) ortamı (% 10 FBS ve 1x HAT Takviyesi ile desteklenmiş DMEM) içeren 96 oyuklu plakalarda 0.1-0.2 × 105 / mL yoğunlukta tohum peritoneal makrofajlar ve gece boyunca 37 ° C,% 6CO2 nemlendirilmiş atmosferde inkübe edin.
- Hibridizasyon için, SP2 / 0 hücrelerini 8-10 şişeden bir pipetle nazikçe aspire edin ve 10 mL serumsuz DMEM ortamında askıya alın. Hücreleri taze DMEM ile yıkayın, iki kez santrifüjleyin (1500 × g, 10 dakika) ve ardından 10 mL DMEM'de yeniden süspanse edin.
- Niceliksel dalak hücrelerini SP2/0 hücreleri ile 10:1 oranında karıştırın ve 50 mL'lik tüplere aktarın. Santrifüjleyin (1500 × g, 10 dakika) ve süpernatanı atın. Hücre peletlerini tüplerin altında toplayın ve hibridizasyondan önce peletleri gevşetmek için avuç içi ile hafifçe vurun.
- Önceden 37 °C'ye ısıtılmış 1 mL polietilen glikol 1500 (PEG 1500) ekleyin, tüpün tabanını hafifçe döndürürken 45 s süre boyunca gevşetilmiş hücre peletine bir damlalık kullanarak damla damla ekleyin.
- Yukarıdaki karışıma 90 s boyunca 37 ° C'ye önceden ısıtılmış 1 mL DMEM'i yavaşça ekleyin, ardından 30 mL daha taze DMEM ekleyin. Füzyon tüpünü 30 dakika boyunca 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
- Ilık banyoda inkübasyondan sonra, hücreleri hasat edin ve HAT ortamında tekrar süspanse edin. Daha sonra peritoneal makrofajlarla aşılanmış 96 oyuklu bir plakada kültür.
- Beş gün sonra, her bir oyuğa 100 μL taze HAT ortamı ekleyin ve plakayı 5 gün daha inkübe edin, ardından ortamı HT ortamı ile değiştirin (% 10 FBS ve 1x HT Takviyesi ile desteklenmiş DMEM).
- ELISA testi kullanılarak hibridoma süpernatantındaki monoklonal antikorları analiz etmek için 0.05 M PBS (pH 9.6) ile seyreltilmiş 5 μg/mL APN proteini ile kaplanmış bir mikrotitre plakası kullanın.
- 96 oyuklu plakanın oyuklarındaki ortam sarardığında (hücre büyümesi ve metabolit salınımı nedeniyle, ortamdaki pH 6.8'e düşer ve fenol kırmızısı fuşyadan sarıya döner) veya hücre kümeleri gözlendiğinde, seçilen oyuklardan 100 μL süpernatant alın ve kaplanmış ELISA plakasının kuyucuklarına ekleyin. Optik yoğunluk 450 (OD450) değerlerini ölçmek için bir mikroplaka okuyucu kullanın.
- APN'ye ve enfekte olmayan fare serumuna karşı poliklonal antikorları sırasıyla pozitif ve negatif kontrol olarak kullanın ve PBS'yi boş kontrol olarak kullanın. Bu çalışmada, numunenin OD450 negatif kontrol oranı (P/N) ≥ 2.1, pozitif seçim standardı olarak kabul edilmiştir.
- Ardışık üç pozitif seçim turundan sonra, sınırlı bir seyreltme testi için APN proteinine karşı artmış seroloji yanıtı gösteren hibridomayı seçin.
- Peritoneal makrofajları hazırlayın ve daha önce tarif edildiği gibi 96 oyuklu plakalarda tohumlayın.
- Hibridoma hücrelerini HT ortamında kuyu başına ortalama 0.5-2 hücrede askıya alın ve 37 ° C,% 6 CO2 inkübatörde kültürleyin. ELISA immunoassay ile gösterilen pozitif oran %100'e ulaşana kadar bu adımı üç veya dört kez tekrarlayın.
- Sürekli donma ve çözülme baskısı altında, anti-APN antikorlarını stabil bir şekilde salgılayabilen ve normal şekilde çoğalabilen pozitif hibridoma hücrelerini seçin.
- Her fareye (8-10 hafta) 0.3 mL prizan enjeksiyonu tek bir ip uygulayın. Bozulmamış aldıktan 10 gün sonra, her fareye 0.5 mL PBS'de (pH 7.2) 2-5 x10 5 hibridoma hücresi enjekte edin.
- Enjeksiyondan 8 ila 10 gün sonra bu farelerin periton boşluğundan periton sıvısını dikkatlice toplayın.
- Süpernatanları 15 dakika boyunca 5.000 × g'da santrifüjleme ile hasat edin ve %33 doymuş amonyum sülfat [(NH4)2S04] çökeltme ve protein A agaroz kullanarak süpernatanlardaki antikorları saflaştırın.
4. APN proteinine karşı monoklonal antikorların (mAbs) karakterizasyonu
- Bir SBA Klonotipleme Sistemi-HRP kullanarak toplanan mAb'lerin immünoglobulin alt tipini belirleyin. mAb saflığını ve özgüllüğünü değerlendirmek için SDS-PAGE ve western blotting kullanın.
- ELISA kullanarak APN proteinine karşı mAb epitop özgüllüğünü analiz edin. Katkı değeri (AV), mAbs'nin aynı antijenik bölgeyi tanıyıp tanımadığını değerlendirmek için kullanılan ODmAbs'nin (a+b) (ODmAbs-a+ODmAbs-b) oranıdır; ODmAbs-a ve ODmAbs-b, tek başına APN'ye karşı farklı monoklonal antikorların OD450 değerlerini temsil eder ve ODmAbs (a+b), APN'ye karşı iki mAb'nin 1:1 karışımının OD450 değerlerini temsil eder.
- Her numuneyi en az dört tekrar değerlendirin ve tüm deneyi en az üç kez tekrarlayın.
5. APN'ye karşı rAb'lerin ifadesi
- Yukarıda belirtilen hibridoma hücrelerinden ve APN ile aşılanmış farelerin dalaklarından toplam RNA'yı çıkarın (ör., TRIzol). Üreticinin talimatlarına göre bir cDNA sentez kiti kullanarak tamamlayıcı DNA (cDNA) sentezleyin.
- İç içe polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanarak mAb'lerin değişken bölgelerini amplifiye edin ve dizileme kullanarak ağır zincir (VH) ve hafif zincir (VL) dizilerini belirleyin. IMGT fare genom analiz aracını (http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php) kullanarak VH ve VL'yi kodlayan genleri analiz edin.
- VH ve VL genlerini lider dizilerle birleştirin ve yara izi bırakmadan DNA parçası eklemeye izin vermek için dikişsiz klonlama teknolojisini kullanarak bunları sırasıyla pET28a (+) ve pIRES2-ZsGreen1 vektörlerine sırayla alt klonlayın. Spesifik primerler Tablo 1'de listelenmiştir.
- pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 transforme olmuş bakterileri 0,4 mM IPTG varlığında orbital çalkalayıcılarda 37 °C'de 10 saat boyunca büyütün. Daha sonra rutin protein saflaştırmasını kullanarak rAbs proteininin ekspresyonunu indükleyin, saflaştırın ve değerlendirin.
- Oyuk başına 100 μL 0.5 x 105 CHO hücresini 96 oyuklu bir plakaya tohumlayın ve 37 ° C'de% 6 CO2 atmosferinde 18-24 saat inkübe edin. Hücreler %80-90 birleşmeye ulaştığında, pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN plazmitini Opti-MEM ile 0.1 μg/μL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin ve transfeksiyon için kullanmadan önce oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
- 50 μL seyreltilmiş pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN plazmitini 1 μL Lipofectamine 2000 ve 49 μL Opti-MEM ile nazikçe karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında 20 dakika daha inkübe edin. CHO hücreleri içeren 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 100 μL karışım ekleyin ve 37 ° C'de% 6 CO2 atmosferinde 4-6 saat inkübe edin.
- Transfeksiyondan 4-6 saat sonra, ortamı %10 FBS ile takviye edilmiş DMEM-F12 ortamı ile değiştirin ve plakayı 48 saat daha inkübe edin. Ardından, stabil şekilde transfekte edilmiş hücreleri seçmek için her bir oyuğa 400 μg / mL G418 ekleyin.
- % 10 FBS ve% 400 μg / mL G418 ile takviye edilmiş DMEM-F12 ortamı kullanılarak 10 günlük seçimden sonra, hücreleri (3.0 × 107 hücre / mL) floresanla aktive edilen hücre sıralaması ile sıralayın. Hücre popülasyonunun yaklaşık% 10-15'i pozitifti.
- Hasat edilen pozitif hücreleri seri olarak seyreltin, 96 oyuklu bir plakada oyuk başına ortalama 0.5-2 hücrede tohumlayın ve 37 ° C,% 6 CO2 inkübatörde kültürleyin. G418 (200 μg/mL) ile seçim kullanarak stabil şekilde transfekte edilmiş pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO hücrelerini koruyun.
- Yukarıda tarif edilen hücre kültürü ortamındaki FBS konsantrasyonu, 3 haftalık bir süre boyunca logaritmik büyüme fazı sırasında kademeli olarak %10'dan %0'a düşer. Daha sonra, yapışık CHO hücrelerini serum içermeyen bir ortamda süspansiyon büyümesine adapte edin.
- Tohumlanmış pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO hücrelerini, serum içermeyen ortamda serum içermeyen ortamda 0.8-1.0 × 105 hücre/mL yoğunlukta 80-110 rpm çalkalama hızında ve 37 ° C,% 6 CO2'de kültürleyin.
- Üreticinin talimatlarına göre bir hücre sayma kiti (örneğin, CCK-8) kullanarak hücre canlılığı ve canlılığındaki değişiklikleri belirlemek için hücre süspansiyonunu her 12 saatte bir toplayın.
- Antikor ekspresyonu, hücre canlılığı %80'e düştüğünde ve hücre yoğunluğu 1.0-2.0 × 106 hücre/mL'ye ulaştığında pik seviyelere ulaşır. Santrifüjleme kullanarak hücre süpernatantlarını hasat edin, 0.22 μm politetrafloroetilen membran filtresi kullanarak filtreleyin ve protein A agaroz kullanarak saflaştırın.
- Dolaylı immünofloresan testleri (IFA) kullanarak APN'ye özgü antikorların üretimini doğrulayın.
- Daha önce tarif edildiği gibi ELISA testini kullanarak antikor titrelerini ve bağlanma afinitelerini belirleyin. Yazılım kullanarak dört parametreli bir lojistik denklem ile antikorların denge ayrışma sabitini (KD değeri) hesaplayın.
Tablo 1. Bu çalışmada kullanılan spesifik primerler.
| Astar | Sıra (5'-3') |
| VH-VL-F | CCGGGTGGGCCGGATAGACMGATGGGGCTG |
| VH-VL-R | CCGGCCACATAGGCCCCACTTGACATTGATGT |
| pET28a (+)-F | TCCACCAGTCATGCTAGCCATAACAACGGTCGTGATTCGA |
| pET28a (+)-R | CTGGTGCCGCGCGGCAGCCAGTGGGATACCCGTATTACCC |
| pIRES2-ZsYeşil1-F | CGACGGTACCGCGGCCCGGTAACAACGGTCGTGATTCGA |
| pIRES2-ZsYeşil1-R | GGGGGGGAGGGAGAGGCGGTGGGATACCCGTATTACCC |
