Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. PBMC'lerin izolasyonu ve NK hücrelerinin zenginleştirilmesi/saflaştırılması
>NOT: Periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) izolasyonu ve zenginleştirme/saflaştırma için başka yöntemler de gerçekleştirilebilir.
- Düzenlenmiş koşullar altında 200 mL kanı heparin içeren bir tüpe alın.
- Gözenekli bir bariyer içeren 50 mL'lik bir tüpe 15 mL yoğunluk gradyan ortamı ekleyin. Tüpü 30 saniye boyunca 1000 x g'da döndürün.
- Tüpe 12.5 mL kan ekleyin, ardından 12.5 mL PBS daha ekleyin ve 3x'i yavaşça ters çevirin. Tüpü oda sıcaklığında (RT) ara vermeden 15 dakika boyunca 800 x g'da döndürün.
- Hücreler dönerken gözenekli bir bariyere sahip her tüp için 40 mL PBS'li 50 mL'lik bir konik tüp hazırlayın.
- Tüpleri dikkatlice çıkarın ve santrifüjlemeden sonra kontrol edin. 50 mL'lik tüp üzerindeki 20 mL ve 25 mL sınırlar arasında, gözenekli bariyerin üzerinde ince, gözle görülür şekilde beyaz bir PBMC tabakası olup olmadığını kontrol edin.
- İnce, beyaz PBMC katmanını bozmadan bir pipet kullanarak üstten mümkün olduğunca fazla sıvıyı dikkatlice çıkarın.
- Temiz bir 10 mL serolojik pipetle, berrak, sarımsı sıvı tabakasına ek olarak PBMC tabakasını da tüpün filtresine kadar nazikçe çıkarın.
- PBMC'leri ve sıvıyı, adım 1.4'te hazırlanan 50 mL konik PBS içeren içine boşaltın. Tüpleri RT ve 300 x g'da 5 dakika döndürün.
- PBS yıkamasını aspire edin ve 40 mL daha PBS ekleyin. Tüpleri RT ve 300 x g'da 5 dakika döndürün.
- Yıkadıktan sonra, hücreleri sayın ve 1 x 107 hücre başına 40 μL% 2 BSA / PBS'de yeniden süspanse edin.
- Tercih edilen yöntemi kullanarak NK hücrelerinin izolasyonuna devam edin. Seçenekler arasında manuel veya otomatik manyetik boncuk tabanlı sıralama bulunur. Floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması da yapılabilir.
- Akış sitometrisi ile NK hücrelerinin saflığını belirlemek için küçük bir hücre alikotunu çıkarın. Geçit stratejisi aşağıdakileri içerir: ileri ve yan saçılma profiline dayalı olarak canlı hücrelere geçit yapın, ardından belirli canlı popülasyondaki NK belirteçlerine (örneğin, CD3, CD56) dayalı saflığı değerlendirin. Tipik saflık% >95'tir.
- İzolasyon tamamlandıktan sonra, hücreleri RT ve 300 x g'da 5 dakika boyunca döndürün ve aspire edin.
- Hücre peletini besinler, %10 ısıyla inaktive edilmiş FBS, 1 mM sodyum piruvat, 55 mM 2-ME ve 10 mM HEPES (pH = 7.2) ile RPMI 1640'ta 1 x 107 hücre / mL'ye yeniden süspanse edin.
>2. NK hücrelerinin FcγRIIIa yoluyla antikor aracılı aktivasyonu
- Soğutulmuş bir mikrosantrifüjü 4 °C'ye ayarlayın.
- 1 x 106 (100 μL) yeniden süspanse edilmiş NK hücresini 1,5 mL tüp(ler)e dağıtın ve buzun üzerine yerleştirin.
not: Çok sayıda numune varsa, hücreler 96 kuyulu bir U-alt plakaya dağıtılabilir.
- Örnek başına 1 μL 100 μg/mL rituksimab (veya ilgilenilen antikor) hazırlayın ve 1 μg/mL antikorun nihai konsantrasyonu için hücrelere 1 μL ekleyin.
not: Kombinasyon etkilerinin değerlendirilmesi için hücrelere bu noktada veya daha erken başka moleküller eklenebilir. Burada, stimülasyon için ritixumab kullanıldı. Önceki çalışmalarda, stimülasyonlara küçük molekül inhibitörleri eklenmiştir.
- Numuneyi buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. İnkübasyon sırasında, ortamdaki numune başına 50 μL 50 μg/mL anti-insan κ hafif zincir antikoru hazırlayın ve bir ısı bloğunda veya bir su banyosunda 37 °C'ye ısıtın.
- Hücrelerin buz üzerinde inkübe edilmesinden sonra, 1 mL buz gibi soğuk ortam ekleyin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 135 x g'da döndürün. 1 mL buz gibi soğuk ortam ile tekrar yıkayın.
- Son yıkamadan sonra süpernatanı aspire edin ve adım 2.4'te hazırlanan anti-insan κ hafif zincir karışımından 50 μL ekleyin.
- 37 °C'de son kullanıcı tarafından belirlenen zaman noktaları için numuneleri hemen bir ısı bloğunda veya bir su banyosunda inkübe edin.
- 1 mL buz gibi soğuk ortam ekleyerek stimülasyonu durdurun ve numuneleri hemen soğutmalı bir santrifüjde 135 x g'da 5 dakika boyunca döndürün. 1 mL buz gibi soğuk ortam ile bir kez daha yıkayın.
