Antijene Özgü B Hücrelerinden Monoklonal Antikorlar Üretmek İçin Bir Teknik

Özet

Kaynak: Devilder, M., et al. Kanda Dolaşan Nadir Antijene Özgü B Hücrelerinden Ayrımcı İnsan Monoklonal Antikorlarının Üretilmesi. J. Vis. Uzm. (2018).

Video, antijene özgü B hücrelerinden monoklonal antikorlar üretmek için bir tekniği göstermektedir. İzole edilmiş antijene özgü B hücrelerinden klonlanan antikorların ağır ve hafif zincirlerini kodlayan ökaryotik ekspresyon vektörleri, polipleksler kullanılarak memeli hücrelerine sokulur. Hücrelerin içine girdikten sonra, bu vektörler translasyona uğrar ve elde edilen ağır ve hafif zincirli peptitler, daha sonra hücreler tarafından salgılanan antikorlara dönüşür.

Protokol

1. mAb üretimi

1. Transfeksiyondan bir gün önce, 15.000 İnsan embriyonik böbrek 293A (HEK 293A) hücresini, 96 oyuklu plakalarda oyuk başına% 10 FBS ile desteklenmiş 200 μL Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyerinde (DMEM) tohumlayın. 37 ° C'de bir CO₂ inkübatöründe (% 5 CO₂) gece boyunca inkübe edin.
2. Transfeksiyon reaktifi olarak doğrusal bir polietilenimin türevi kullanılarak %10 FBS içeren DMEM ortamındaki Cotransfect 293A hücreleri.
   not: Transfeksiyonu üç nüsha halinde gerçekleştirin. Aşağıdaki protokol, düz tabanlı 96 oyuklu bir plakanın bir kuyusu içindir.
   1. 0.5 μL DNA transfeksiyon reaktifini 10 μL 150 mM NaCl'ye seyreltin. 0.125 μg değişken ağır zincir (vH) ve 0.125 μg değişken hafif zincir (vL) eksprese eden vektörleri 10 μL 150 mM NaCl'ye seyreltin. Her seyreltmeyi 10 saniye boyunca vorteksleyin.
   2. 10 μL DNA çözeltisine 10 μL seyreltilmiş DNA transfeksiyon reaktifi ekleyin. 15 saniye vorteksleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. 20 μL'lik karışımı 293A hücrelere damla damla ekleyin ve plakayı hafifçe döndürerek karıştırın.
3. Transfeksiyon ve kültür hücrelerinden 16 saat sonra ortamı 5 gün boyunca serumsuz ortamda değiştirin.
   not: Üretilen antikorları kontamine eden serum immünoglobulinlerini (Ig'ler) önlemek için serum içermeyen ortam kullanın.
4. 5 dakika boyunca 460 x g'da santrifüjleme ile hücreleri ve kalıntıları ortadan kaldırın.
5. Süpernatanları çok kanallı bir pipetle aspirasyon yoluyla hasat edin ve bunları V tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın.
6. İlgili Ag'yi gece boyunca 4 ° C'de 100 μL'de, sulandırılmış enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) / enzime bağlı immünosorbent nokta (ELISPOT) kaplama tamponu 1x'de 2 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyonda 96 oyuklu ELISA plakalarında kaplayın.
7. 37 ° C'de 2 saat boyunca% 10 FBS DMEM ortamı ile kuyuları bloke edin.
8. Adım 1.5'ten transfekte edilmiş 293A hücrelerinin 50 μL süpernatantlarını ekleyin ve RT'de 2 saat inkübe edin.
9. 1 μg / mL'de yaban turpu peroksidaz (HRP) enzimine konjuge edilmiş 100 μL bir anti-insan İmmünoglobulin G antikoru (IgG Ab) ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. 50 μL kromojenik substrat (3,3 ', 5,5' tetrametilbenzidin, TMB) ekleyin ve 20 dakika inkübe edin.
10. Spektrofotometrede 450 nm'de optik yoğunlukları okuyun.
    not: ELISA testi ile ortaya çıkan spesifik mAb'ler daha büyük ölçekte üretilebilir ve insan IgG'sine afinite sunan protein A sütunu üzerinde saflaştırılabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
HEK 293A hücre hattı	Thermo Fisher bilimsel	R70507
DMEM (1X) Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı	Gibco by life technologies	21969-035	(+) 4,5g/L D-Glikoz 0,11g/L Sodyum Piruvat (-) L-Glutmin
Nutridoma-SP	Roche	11011375001	100X Konsantre
Fetal Sığır serumu (FBS)	Dominique Dutscher	S1810-500 Serisi
Jet PEI DNA transfeksiyon reaktifi	PolyPlus (PolyPlus)	101-40
Düz tabanlı96 oyuklu plaka	doğan	353072
V tabanlı 96 oyuklu plaka	Nunc/Termo Balık Avcısı	55142

Serisi