Konveksiyonla Geliştirilmiş Antikorların Fare Beynine İletilmesi

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Basamak Kateterlerinin Hazırlanması

1. Kateterin basamağı için kaynaşmış bir silika borunun hazırlanması
   1. İç çapı 0,1 mm ve duvar kalınlığı 0,0325 mm olan erimiş silika kılcal damarı, boruyu 30 mm uzunluğa kadar kesin.
   2. Boruda çatlak olup olmadığını inceleyin ve boru açıklıklarının pürüzsüz bir yüzeye sahip olduğundan emin olmak için uçları bir mikro dövme kullanarak ısıyla parlatın.
2. İç borunun metal bir iğneye sabitlenmesi
   1. 27 G'lik bir iğneyi 10 μL'lik bir şırıngaya monte edin ve şırıngayı stereotaktik bir robota yerleştirin.
   2. Robotu kullanarak şırıngayı sert bir yüzey üzerinde hareket ettirin ve iğne ucuyla dokunun. Bu pozisyon, kateter basamağının uzunluğunu ayarlamak için bir referans yüzeyi görevi göreceği için yazılıma not edilmeli veya kaydedilmelidir.
   3. Kaynaşmış silika kılcal damarın iğnenin içine yerleştirilmesini sağlamak için iğneyi kaldırın.
   4. Erimiş silika kılcalını, kılcal damarın 20 mm'si iğneden dışarı çıkacak şekilde iğneye yerleştirin.
   5. Bir pipet kullanarak, Şekil 2'de gösterildiği gibi, metal iğneden başlayarak ve kılcal damarın alt ucunun 10 mm üzerinde bitirerek 1 μL yüksek viskoziteli siyanoakrilat yapıştırıcıyı kılcal damarın üzerine eşit şekilde yayın.
   6. Stereotaktik robotu kullanarak, metal iğnenin ucu referans yüzeyinin 1 mm üzerinde olana kadar iğneyi indirin. Bu şekilde, erimiş silika kılcal, uçtan 1 mm'lik bir adım oluşturacak şekilde metal iğneye sabitlenecektir. Adımın körelmesini önlemek için metal iğnenin ucunda oluşan fazla yapıştırıcıyı çıkarın.
   7. Yapıştırıcının sertleşmesi için 15 dakika bekleyin ve kateterli şırıngayı stereotaktik robottan çıkarın. Kateterin ucunu mikroskop altında kontrol ederek adımdaki tüm fazla yapıştırıcının çıkarıldığını onaylayın.
3. Basamaklı kateterin bir agaroz bloğu kullanılarak test edilmesi
   1. Geleneksel bir jel tepside fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 0.6 agaroz çözeltisi hazırlayın ve polimerize olana kadar bekleyin. Agarozu yaklaşık 20 mm x 20 mm'lik bloklar halinde kesin. Kullanana kadar blokları PBS'ye batırılmış halde tutun.
   2. Basamaklı kateter şırıngasını 10 μL% 0.4 filtrelenmiş tripan mavisi çözeltisi ile manuel olarak doldurun.
   3. Stereotaktik robotu kullanarak, fiksasyon prosedürü sırasında kateter adımının sızdırmazlığını değerlendirmek için 0,2 μL/dk'da 1 μL dağıtın. Tripan mavisi çözeltisi sadece kateterin ucunda görünmelidir. Bir kağıt mendille silin.
   4. Agaroz bloğunu stereotaktik robota yerleştirin ve robotu, kateterin ucu agaroz bloğunun yüzeyine referans
   alınacak şekilde kalibre edin.
   5. CED için enjeksiyon parametrelerini programlayın.
      1. 5 μL'lik enjeksiyon hacmi için aşağıdaki adımları kullanın: 0,2 μL/dk'da 1 μL, ardından 0,5 μL/dk'da 2 μL ve 0,8 μL/dk'da 2 μL. Adımların her birinin süresini orantılı olarak değiştirerek son enjeksiyon hacmini belirli deney planına göre ayarlayın.
      2. Çözeltiyi murin kaudat putamen (striatum) içine enjekte etmek için, bu enjeksiyonu 3.5 mm derinlikte bregma'dan 1 mm ön ve 1.5-2 mm yan pozisyonda gerçekleştirin.
      3. Enjeksiyondan sonra, kateteri 2 dakika yerinde bırakın ve ardından beyinde uygun sıvı dağılımını sağlamak için 1 mm / dk'da geri çekin ve kateter çıkarılırken enjeksiyon yolunu kapatın><. not: Tüm parametreler, belirli stereotaktik robota bağlı olarak tek bir komut dosyasına programlanabilir.
   6. CED prosedürünü başlatın ve agaroz bloğuna 5 μL tripan mavisi çözeltisi enjekte edin.
   7. Agarozdaki tripan mavisi bulutunun şeklini ve kateter yolu boyunca olası sızıntıyı değerlendirin. Tripan mavisi, merkezi kateter ucunun etrafında ve en az 1 mm çapında bir elipsoid veya yuvarlak bir bulut oluşturmalıdır. Metal iğnenin ucu üzerinde büyük bir geri akış görünmemelidir.
   8. Yeni bir agaroz bloğu yerleştirin ve kateterin agaroz ile tıkanmasını değerlendirmek için 0.2 μL/dk'da 1 μL'lik ikinci bir enjeksiyona başlayın. Tripan mavisi, enjeksiyonun başlamasından hemen sonra kateterin ucundan tekrar bir bulut oluşturmaya başlamalıdır.
   9. Şırıngada kalan hacmin 3 μL'ye karşılık gelip gelmediğini değerlendirin. Herhangi bir değişiklik, kateter montajından veya şırınga pistonundan sıvı sızıntısını gösterebilir.
   10. Tüm test enjeksiyonları başarılı olursa, kateter iyi bir şekilde kapatılmış ve düzdür ve kateter ucu dışındaki noktalardan tripan mavisi çözeltisi gözlenmezse, kateteri deiyonize H₂O (dH₂O) ile tripan mavisi izi görünmeyene kadar yıkayın ve ardından aşağıdaki gibi on kez yıkayın: %70 etanol ve %100 etanol ardından tekrar %70 etanol ve temiz deiyonize su ile yıkayın.
   11. Kateteri kuru koşullarda saklayın.

2. Konveksiyonla geliştirilmiş Antikor Çözeltisinin Murin Beynine İletilmesi

>NOT: Yerel hayvan refahı düzenlemelerine bağlı olarak, bu prosedür için çeşitli anestezikler, analjezikler ve antibiyotikler uygulanabilir. Bu protokol enjeksiyon anestezisinin kullanımını açıklar. İzofluran gibi inhalasyon anestezikleri, stereotaktik çerçeveye bir burun maskesi monte edilerek de kullanılabilir. Ek olarak, enfeksiyon profilaksisi için içme suyuna antibiyotik eklenmesini öneririz.

1. Cerrahi kurulum
   1. Anestezik ve panzehir solüsyonları hazırlayın. Fareler, steril damıtılmış su (_dH2O) içinde seyreltilmiş fentanil (0.05 mg / kg), midazolam (5 mg / kg) ve medetomidin (0.5 mg / kg) içeren üç bileşenli bir anestezi kullanılarak güvenli bir şekilde anestezi edilebilir. Steril dH_2O(birinci antidot çözeltisi) içinde biri flumazenil (0.5 mg/kg) ve buprenorfin (0.1 mg/kg) içeren iki antidot solüsyonu kullanarak iki aşamalı bir uyandırma prosedürü gerçekleştiriyoruz. İkincisi, steril dH₂O (ikinci panzehir çözeltisi) içinde atipamezol (2.5 mg / kg) içerir.
   2. Steril dH₂O ile seyreltilmiş karprofen (5.667 mg / kg) içeren bir analjezi çözeltisi hazırlayın.
   3. Stereotaktik çerçeveyi, ısıtma yastığını ve stereotaktik robotun elemanlarını temizleyin. Tüm robot parçalarının hasar riski olmadan temizlenemeyeceğini unutmayın. Temizlik ve kullanıma hazırlama ile ilgili ayrıntılar için robot kılavuzuna bakın.
   4. Şırıngayı basamaklı kateter ile birleştirin ve dH₂O,% 70 etanol ve% 100 etanol ile birden çok kez yıkayın, ardından% 70 etanol ve% 70 O ile% tekrar yıkayın. Son olarak, çözeltiyi intrakraniyal enjeksiyon, örneğin yapay beyin omurilik sıvısı için hazırlamak için şırıngayı PBS veya diğer tamponlarla yıkayın. Şırınga pistonu işlem sırasında düzgün ve serbestçe hareket etmelidir.
   5. Stereotaktik robot yazılımını stereotaktik çerçeve ile kalibre edin.
   6. Robot kollarının serbestçe hareket ettiğinden, enjeksiyon pompasının uygun şekilde bağlandığından ve CED prosedürünü herhangi bir rahatsızlık olmadan gerçekleştirebildiğinden emin olarak stereotaktik robot yazılımını test edin. Bu, robot hareketinin test edilmesini, enjeksiyonun hızlandırılmasını, 2 dakikalık bekleme adımının kontrol edilmesini ve kateter geri çekilme hızının kontrol edilmesini içerir. Tüm parametreler, madde 1.3.5'te açıklanan önceden programlanmış CED prosedürüne uygun olmalıdır.
   7. Matkap ucunu matkabın içine yerleştirin. Kullanmadan önce matkap uçlarının sterilize edilmesi önerilir.
   8. PBS veya yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) gibi diğer tampon çözeltileri kullanarak antikor çözeltisi hazırlayın. Tek bir CED prosedüründe 5 μL'de 1 ila 20 μg antikor enjekte edilebilir. Deney yapılmadan önce diğer hacimler ve protein miktarları test edilmelidir. Yüksek viskoziteli solüsyonların kullanılmasının kateter tıkanmasına yol açabileceğini unutmayın.
   9. Şırıngayı seyreltilmiş antikorla manuel olarak yükleyin.
2. Striatum içine CED ile antikor enjeksiyonu
   1. Fareyi tartın ve üç bileşenli anestezi solüsyonunu vücut ağırlığına göre peritona enjekte edin. Enjeksiyon süresine dikkat edin. Fareyi bir ısıtma yastığı ile ısıtılan ayrı bir kafese aktarın.
   2. Sedasyonun ne zaman başladığını belirlemek için fareyi gözlemleyin. Fare hareket etmeyi bıraktığında, ameliyat sırasında korneanın kurumasını önlemek için gözlere oftalmik merhem sürün. Tam sedasyon genellikle üç bileşenli anestezi solüsyonunun enjeksiyonundan 10-15 dakika sonra başlar.
   3. Hayvanın tam anestezi almasını sağlamak için çimdik-refleks testini kullanarak ağrı reaksiyonlarını kontrol edin.
   4. Bir saç düzeltici kullanarak kafayı tıraş edin.
   5. Cildi iyot çözeltisine batırılmış pamuklu çubuklarla dezenfekte edin. Cildi dairesel hareketlerle üç kez ovalayın.
   6. Kraniyal orta hat boyunca 10 mm'lik bir cilt kesisi yapın ve bir neşter kullanarak göz hizasında bitirin.
   7. Burun kelepçesi ve kulak çubuklarını kullanarak fareyi stereotaktik çerçeveye sabitleyin. Kafatası yüzeyinin yatay olduğundan ve sıkıca sabitlendiğinden emin olun. Doğru anatomik navigasyonun yanı sıra, delme ve CED prosedürü sırasında kafatasının eğilmesinden kaçınmak da çok önemlidir.
   8. Şırıngayı stereotaktik robota yerleştirin.
   9. Matkap ucunu bir referans noktasındaki kateterin ucuyla senkronize edin. Matkabın konumu ile şırınga arasındaki ilişki, enjeksiyonun beynin istenen anatomik bölgesinde gerçekleştirilebilmesi için yazılımda kesin olarak belirlenmelidir.
   10. Forseps kullanarak cildi geri çekin ve bregmayı kafatasının yüzeyinde lokalize edin.
   11. Matkap ucu ucunu kullanarak yazılımda Bregma'ya referans verin.
   12. Matkabı bregmadan 1 mm ön ve 2 mm yan konuma getirin ve bir çapak deliği açın. Dura mater'e zarar vermemeye dikkat edin.
   13. Şırıngayı çapak deliğinin üzerine getirin.
   14. Kateterde hava kabarcığı kalmadığından emin olmak için şırıngadan 0,5-1 μL dağıtın.
   15. Madde 1.3.5'te açıklanan CED programını başlatın. Enjeksiyon noktasından herhangi bir sıvı geri akışı izi için kafatası yüzeyini gözlemleyin. Hayvanın solunum hızını izleyin.
   16. CED programı bittikten ve kateter beyinden çekildikten sonra, CED sırasında kateter tıkanmasını kontrol etmek için enjeksiyon pompasını 0.2 μL/dk'da başlatın. Herhangi bir tıkanma meydana gelmezse, kateter ucundan hemen bir damla enjeksiyon karışımı görmelisiniz.
   17. Kateteri tekrar kullanmadan veya saklamadan önce, kateter basamağını mikroskop altında herhangi bir hasar veya aşınma belirtisi açısından görsel olarak inceleyin ve adım 1.3.10'daki gibi temizleyin.

Şekil 1: Yapıştırıcının uygulama alanını gösteren şematik bir çizim. Erimiş silika borunun üst 10 mm'si metal iğneye yerleştirilir. Yapıştırıcıyı metal iğnenin ucundan başlayarak 10 mm'lik boruya uygulayın.