Mikroglia tarafından Tau proteini alımını değerlendirmek için hücre bazlı bir test

1. BV-2 Mikroglia Hücre Kültürü

>NOT: BV-2 hücrelerini Biyogüvenlik Düzeyi 2 muhafazası altında kullanın. BV-2 hücre hattı, zarflı bir rekombinant ekotropik retrovirüs üretir (yalnızca murin hücrelerini enfekte edebilir); Bu tür virüsler, in vitro transformasyon yetenekleri ve in vivo tümörjenik potansiyelleri ile bilinir.

1. %10 fetal sığır serumu (FBS), 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin ve 2 mM L-Glutamin (bundan böyle kültür ortamı olarak anılacaktır) ile desteklenmiş yüksek glikozlu Dulbecco'nun modifiye kartal ortamında (DMEM) BV-2 hücrelerinin kültürlenmesi, hücreleri 4 x 10⁴ hücre/mL'de tohumlayarak.
2. Kültürleri 37 ° C'de% 5_CO2 içeren nemlendirilmiş bir atmosferde koruyun < br / > NOT: hücreler gevşek bir şekilde bağlanır ve süspansiyon halinde büyür.

2. Rekombinant Tau Agregalarını pH'a duyarlı Floresan Boya ile etiketleyin

NOT: Tau agregaları Apetri ve ark.reaksiyon tamponuna Thioflavin T (ThT) eklenmemesi farkıyla. Agrega örnekler 1.5 mL'lik santrifüj tüplerinde toplandı. Son floresan sinyali, 118 μL havuz numunesinin 12 μL'lik 50 μM ThT çözeltisi ile karıştırılmasıyla kontrol edildi. Agregalar, agregasyon reaksiyonu karışımının 4 °C'de 1 saat boyunca 20.000 x g'da santrifüjlenmesiyle ayrıldı. Süpernatant, tüm monomerik tauların agregalara dönüştürüldüğünü doğrulamak için SEC-MALS tarafından analiz edildi. Peletler (tau agregaları) donduruldu ve -80 °C'de bir dondurucuda saklandı.

1. Tau agregalarını 0.1 M sodyum bikarbonat tamponunda (NaHCO₃) pH 8.5'te 1 mg / mL (~ 20 μM) konsantrasyonda yeniden askıya alın.
   not: Tau agregalarının konsantrasyonu, 0.31 ^{mLmg-1 cm-1'lik} bir yok olma katsayısı kullanılarak 280 nm'de tau monomerlerinin absorpsiyonu ile değerlendirilen ilk monomer konsantrasyonuna dayanmaktadır.
2. Aşırı ısınmayı önlemek için buz üzerinde tutarken bir prob sonikatörü kullanarak yeniden askıya alınan agregaları sonikleştirin.
   1. % 65'lik bir genlik kullanın (250 W gücünde bir sonikatör ile).
   2. Aşırı ısınmayı önlemek için darbeler arasında 8 saniyelik duraklamalarla 3 saniyelik 15 darbe gerçekleştirin.
3. Üreticinin talimatına uygun olarak dimetil sülfoksit (DMSO) içinde pH'a duyarlı boyadan (bundan böyle pH boyası olarak anılacaktır) 8.9 mM'lik bir stok çözeltisi hazırlayın.
   not: Her zaman taze bir çözelti hazırlayın ve sadece hazırlandığı gün kullanın.
4. 0.2 mM'lik bir son boya konsantrasyonuna mol protein başına 10 mol boya ekleyin.
5. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
6. Reaksiyon karışımını ışıktan koruyarak oda sıcaklığında 45-60 dakika inkübe edin.
7. Bu arada, üreticinin talimatlarına göre çapraz bağlı bir dekstran jel tuz giderme sütunu monte edin.
8. Kolonu 25 mL 0.1 M NaHCO₃ tampon pH 8.5 ile% 3 DMSO içeren dengeleyin. Akışı atın.
9. Tau agrega etiketleme reaksiyonunun ürününü toplam 2,5 mL hacimde kolona ekleyin. Örnek 2,5 mL'den azsa, toplam 2,5 mL'lik bir hacim elde edilene kadar tampon ekleyin.
10. Numunenin paketlenmiş jele tamamen girmesine izin verin, akışı atın.
11. % 3 DMSO içeren 3.5 mL 0.1 M NaHCO₃ tampon pH 8.5 ile elute edin ve elüatı 2 mL tüplerde 4 eşdeğer fraksiyonda toplayın.
12. Bikinkoninik asit (BCA) testi ile 4 fraksiyonun protein konsantrasyonlarını belirleyin.
13. Etiketli proteini -20 °C'lik bir dondurucuda saklayın.

3. Floresanla Aktive Edilen Hücre Sıralama (FACS) Okuması ile Alım Testi

1. 1. Gün – Hücreleri Tohumlayın
   1. Kültür ortamını çıkararak ve 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyerek şişedeki BV-2 hücrelerini yıkayın.
      not: Yıkama hacmi, kullanılan hücre şişesinin boyutuna göre değişecektir. Örneğin, bir T175 şişesi için 10 mL 1x PBS ile yıkayın.
   2. PBS'yi şişeden çıkarın ve 37 ° C'de% 0.05 tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve% 5 CO₂ ile hücreler şişeden ayrılana kadar (yaklaşık 5 dakika) inkübe ederek hücreleri ayırın.
      not: Tripsin-EDTA hacmi% 0.05, kullanılan hücre şişesinin boyutuna bağlıdır. Örneğin, bir T175 şişesi için 2 mL tripsin-EDTA %0.05 kullanın.
   3. Üç ila beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri kültür ortamında yeniden süspanse edin.
      NOT: Kültür ortamının hacmi, kullanılan hücre şişesinin boyutuna ve dolayısıyla şişedeki toplam hücre sayısına bağlı olarak değişir. Örneğin, bir T175 şişesi için 8 mL kültür ortamı kullanın.
   4. Hücreleri sayın ve 200 μg/mL heparin içeren kültür ortamında 1 x 10⁵ hücre/mL nihai konsantrasyona sahip bir hücre süspansiyonu oluşturun.
   5. Plaka: 96 oyuklu doku kültürü düz tabanlı plakada oyuk başına 250 μL hücre süspansiyonu (2.5 x 10⁴ hücre).
   6. Plakayı gece boyunca 37 °C ve% 5 CO_2'de inkübe edin.
2. 1. Gün – İmmünokompleksleri Hazırlayın
   1. PH boya-tau'yu buz üzerinde çözdürün.
   2. Serumsuz ortamda (SFM) (100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin ve 200 μg / mL heparin ile desteklenmiş yüksek glikoz DMEM) 500 nM'lik bir pH boya-tau agregatları çözeltisinin koşulu başına 65 μl hazırlayın.
   3. 65 μl SFM'de antikor dilüsyonlarını finalin iki katı konsantrasyonda hazırlayın. pH boya-tau agregalarını ve antikorları 96 oyuklu bir u-alt plakada karıştırın. Koşul başına nihai hacim şimdi 130 μl'dir ve pH boya-tau agregaları konsantrasyonu 250 nM'dir. Seyreltme plakasını kapatın ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
3. 2. Gün – İmmünokompleks Alımı
   1. Kültür ortamını BV-2 hücrelerinden çıkarın. Hücreleri 100 μL oda sıcaklığında 1x PBS ile bir kez yıkayın.
   2. Çok kanallı bir pipet kullanarak 125 μL immünokompleksleri hücrelere aktarın. Hücreleri immünokomplekslerle 37 ° C'de 2 saat ve% 5 CO_2'de inkübe edin.
   3. Kuluçka ortamını hücrelerden çıkarın ve atın. Hücreleri 100 μL oda sıcaklığında 1x PBS ile bir kez yıkayın.
   4. 1x PBS'yi çıkarın ve hücreleri 37 ° C'de 20 dakika ve% 5 CO 2 boyunca 50 μL tripsin-EDTA % 0.25 ile tedavi edin_.
   5. 200 μL kültür ortamı ekleyin ve hücreleri ayırmak için yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice yeniden süspanse edin. Hücreleri 96 oyuklu bir U-alt plakaya aktarın. Plakayı 400 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.
   6. Plakayı buzun üzerine koyun, kültür ortamını çıkarın ve hücre peletlerini 150 μL buz gibi soğuk 1x PBS'de yeniden süspanse ederek hücreleri iki kez yıkayın. Plakayı 400 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.
   7. Hücreleri buzun üzerine koyun, eklenen 1x PBS'yi çıkarın ve hücre peletlerini 150 μL soğuk FACS tamponunda (1x PBS,% 0.5 sığır serum albümini (BSA), 2 mM EDTA) yeniden süspanse ederek yıkayın. Plakayı 400 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.
   8. Hücreleri buzun üzerine koyun, eklenen FACS tamponunu çıkarın ve hücreleri 200 μL soğuk FACS tamponunda yeniden süspanse edin.
   9. Canlı hücre kapısında 2 x 10⁴ olay elde eden FACS ile örnekleri hemen analiz edin (bkz. adım 4.1).