1. BV-2 Mikroglia Hücre Kültürü
>NOT: BV-2 hücrelerini Biyogüvenlik Düzeyi 2 muhafazası altında kullanın. BV-2 hücre hattı, zarflı bir rekombinant ekotropik retrovirüs üretir (yalnızca murin hücrelerini enfekte edebilir); Bu tür virüsler, in vitro transformasyon yetenekleri ve in vivo tümörjenik potansiyelleri ile bilinir.
- %10 fetal sığır serumu (FBS), 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin ve 2 mM L-Glutamin (bundan böyle kültür ortamı olarak anılacaktır) ile desteklenmiş yüksek glikozlu Dulbecco'nun modifiye kartal ortamında (DMEM) BV-2 hücrelerinin kültürlenmesi, hücreleri 4 x 104 hücre/mL'de tohumlayarak.
- Kültürleri 37 ° C'de% 5CO2 içeren nemlendirilmiş bir atmosferde koruyun < br / >
NOT: hücreler gevşek bir şekilde bağlanır ve süspansiyon halinde büyür.
2. Rekombinant Tau Agregalarını pH'a duyarlı Floresan Boya ile etiketleyin
NOT: Tau agregaları Apetri ve ark.reaksiyon tamponuna Thioflavin T (ThT) eklenmemesi farkıyla. Agrega örnekler 1.5 mL'lik santrifüj tüplerinde toplandı. Son floresan sinyali, 118 μL havuz numunesinin 12 μL'lik 50 μM ThT çözeltisi ile karıştırılmasıyla kontrol edildi. Agregalar, agregasyon reaksiyonu karışımının 4 °C'de 1 saat boyunca 20.000 x g'da santrifüjlenmesiyle ayrıldı. Süpernatant, tüm monomerik tauların agregalara dönüştürüldüğünü doğrulamak için SEC-MALS tarafından analiz edildi. Peletler (tau agregaları) donduruldu ve -80 °C'de bir dondurucuda saklandı.
- Tau agregalarını 0.1 M sodyum bikarbonat tamponunda (NaHCO3) pH 8.5'te 1 mg / mL (~ 20 μM) konsantrasyonda yeniden askıya alın.
not: Tau agregalarının konsantrasyonu, 0.31 mLmg-1 cm-1'lik bir yok olma katsayısı kullanılarak 280 nm'de tau monomerlerinin absorpsiyonu ile değerlendirilen ilk monomer konsantrasyonuna dayanmaktadır.
- Aşırı ısınmayı önlemek için buz üzerinde tutarken bir prob sonikatörü kullanarak yeniden askıya alınan agregaları sonikleştirin.
- % 65'lik bir genlik kullanın (250 W gücünde bir sonikatör ile).
- Aşırı ısınmayı önlemek için darbeler arasında 8 saniyelik duraklamalarla 3 saniyelik 15 darbe gerçekleştirin.
- Üreticinin talimatına uygun olarak dimetil sülfoksit (DMSO) içinde pH'a duyarlı boyadan (bundan böyle pH boyası olarak anılacaktır) 8.9 mM'lik bir stok çözeltisi hazırlayın.
not: Her zaman taze bir çözelti hazırlayın ve sadece hazırlandığı gün kullanın.
- 0.2 mM'lik bir son boya konsantrasyonuna mol protein başına 10 mol boya ekleyin.
- Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
- Reaksiyon karışımını ışıktan koruyarak oda sıcaklığında 45-60 dakika inkübe edin.
- Bu arada, üreticinin talimatlarına göre çapraz bağlı bir dekstran jel tuz giderme sütunu monte edin.
- Kolonu 25 mL 0.1 M NaHCO3 tampon pH 8.5 ile% 3 DMSO içeren dengeleyin. Akışı atın.
- Tau agrega etiketleme reaksiyonunun ürününü toplam 2,5 mL hacimde kolona ekleyin. Örnek 2,5 mL'den azsa, toplam 2,5 mL'lik bir hacim elde edilene kadar tampon ekleyin.
- Numunenin paketlenmiş jele tamamen girmesine izin verin, akışı atın.
- % 3 DMSO içeren 3.5 mL 0.1 M NaHCO3 tampon pH 8.5 ile elute edin ve elüatı 2 mL tüplerde 4 eşdeğer fraksiyonda toplayın.
- Bikinkoninik asit (BCA) testi ile 4 fraksiyonun protein konsantrasyonlarını belirleyin.
- Etiketli proteini -20 °C'lik bir dondurucuda saklayın.
3. Floresanla Aktive Edilen Hücre Sıralama (FACS) Okuması ile Alım Testi
- 1. Gün – Hücreleri Tohumlayın
- Kültür ortamını çıkararak ve 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyerek şişedeki BV-2 hücrelerini yıkayın.
not: Yıkama hacmi, kullanılan hücre şişesinin boyutuna göre değişecektir. Örneğin, bir T175 şişesi için 10 mL 1x PBS ile yıkayın.
- PBS'yi şişeden çıkarın ve 37 ° C'de% 0.05 tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve% 5 CO2 ile hücreler şişeden ayrılana kadar (yaklaşık 5 dakika) inkübe ederek hücreleri ayırın.
not: Tripsin-EDTA hacmi% 0.05, kullanılan hücre şişesinin boyutuna bağlıdır. Örneğin, bir T175 şişesi için 2 mL tripsin-EDTA %0.05 kullanın.
- Üç ila beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri kültür ortamında yeniden süspanse edin.
NOT: Kültür ortamının hacmi, kullanılan hücre şişesinin boyutuna ve dolayısıyla şişedeki toplam hücre sayısına bağlı olarak değişir. Örneğin, bir T175 şişesi için 8 mL kültür ortamı kullanın.
- Hücreleri sayın ve 200 μg/mL heparin içeren kültür ortamında 1 x 105 hücre/mL nihai konsantrasyona sahip bir hücre süspansiyonu oluşturun.
- Plaka: 96 oyuklu doku kültürü düz tabanlı plakada oyuk başına 250 μL hücre süspansiyonu (2.5 x 104 hücre).
- Plakayı gece boyunca 37 °C ve% 5 CO2'de inkübe edin.
- 1. Gün – İmmünokompleksleri Hazırlayın
- PH boya-tau'yu buz üzerinde çözdürün.
- Serumsuz ortamda (SFM) (100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin ve 200 μg / mL heparin ile desteklenmiş yüksek glikoz DMEM) 500 nM'lik bir pH boya-tau agregatları çözeltisinin koşulu başına 65 μl hazırlayın.
- 65 μl SFM'de antikor dilüsyonlarını finalin iki katı konsantrasyonda hazırlayın. pH boya-tau agregalarını ve antikorları 96 oyuklu bir u-alt plakada karıştırın. Koşul başına nihai hacim şimdi 130 μl'dir ve pH boya-tau agregaları konsantrasyonu 250 nM'dir. Seyreltme plakasını kapatın ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
- 2. Gün – İmmünokompleks Alımı
- Kültür ortamını BV-2 hücrelerinden çıkarın. Hücreleri 100 μL oda sıcaklığında 1x PBS ile bir kez yıkayın.
- Çok kanallı bir pipet kullanarak 125 μL immünokompleksleri hücrelere aktarın. Hücreleri immünokomplekslerle 37 ° C'de 2 saat ve% 5 CO2'de inkübe edin.
- Kuluçka ortamını hücrelerden çıkarın ve atın. Hücreleri 100 μL oda sıcaklığında 1x PBS ile bir kez yıkayın.
- 1x PBS'yi çıkarın ve hücreleri 37 ° C'de 20 dakika ve% 5 CO 2 boyunca 50 μL tripsin-EDTA % 0.25 ile tedavi edin.
- 200 μL kültür ortamı ekleyin ve hücreleri ayırmak için yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice yeniden süspanse edin. Hücreleri 96 oyuklu bir U-alt plakaya aktarın. Plakayı 400 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.
- Plakayı buzun üzerine koyun, kültür ortamını çıkarın ve hücre peletlerini 150 μL buz gibi soğuk 1x PBS'de yeniden süspanse ederek hücreleri iki kez yıkayın. Plakayı 400 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.
- Hücreleri buzun üzerine koyun, eklenen 1x PBS'yi çıkarın ve hücre peletlerini 150 μL soğuk FACS tamponunda (1x PBS,% 0.5 sığır serum albümini (BSA), 2 mM EDTA) yeniden süspanse ederek yıkayın. Plakayı 400 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.
- Hücreleri buzun üzerine koyun, eklenen FACS tamponunu çıkarın ve hücreleri 200 μL soğuk FACS tamponunda yeniden süspanse edin.
- Canlı hücre kapısında 2 x 104 olay elde eden FACS ile örnekleri hemen analiz edin (bkz. adım 4.1).
