1. Antikorun saflaştırılması
NOT: Ev içi antikor için dengeleme tamponu 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.5'tir. Kullanılan elüsyon tamponu 0.1 M asetik asittir. Tamponlar ve reçine (Protein A), saflaştırılan spesifik antikora bağlıdır. Kolon hacmi reçinenin yatak yüksekliğine eşdeğerdir. Kullanılan mobil faz miktarı kolon hacmine göre belirlenir.
- Arıtma sisteminin başlatılması
- Arıtma sistemine bağlı yazılımı açın. Manuel talimatları kullanarak, sütunu 2 dakika boyunca 40 mL/dk akış hızında dengeleme tamponu ile dengeleyin. Dengelemeden sonra manuel çalıştırmayı durdurun.
- Fraksiyon toplayıcıya, saflaştırılmış antikor elüatını toplamak için 15 mL konik tüpleri ve yüksek tuzlu yıkama sırasında akışı toplamak için 50 mL konik tüpleri yerleştirin. Çalışmaya başlamadan önce fraksiyon toplayıcıyı açıp kapatarak fraksiyon toplayıcının başlangıç konumuna sıfırlandığından emin olun. Fraksiyon toplayıcı 7 °C.
'de tutulur
not: Fraksiyon toplayıcı, hem 15 mL hem de 50 mL tüpler için Ayarlar'daki Fraksiyon Toplayıcı sekmesi altında manuel olarak sıfırlanabilir.
- Numune enjeksiyonu
not: Aşağıdaki prosedürlerde kullanılan hasat edilmiş hücre kültürü sıvısı, otomatik mikro-biyoreaktörlerde kültürlenen Çin hamster yumurtalık hücrelerinden elde edilmiştir.
- 0.22 μm filtrelenmiş hasat hücre kültürü sıvısını, meme ucu kapaklı boş 12 mL'lik bir şırıngaya ekleyin.
- Şırıngayı, nozul aşağı bakacak şekilde tutarak, şırınga pistonunu, pistonun küçük bir kısmı içeri girene kadar yerleştirin. Sıvının sızmadığından emin olarak, şırıngayı nozul yukarı bakacak şekilde çevirin ve kapağı çıkarın.
- Şırıngayı nozul yukarı bakacak şekilde tutmaya devam ederek, hücre kültürü sıvısı nozulun ucuna gelene kadar herhangi bir havayı boşaltmak için silindiri itin. Şırınga memesini arıtma sistemindeki manuel enjeksiyon portuna yerleştirin ve sıkmak için çevirin.
- Tüm numune enjekte edilene ve ekli 10 mL büyük hacimli numune döngüsünde görünene kadar pistonu aşağı doğru bastırın.
- Kaydedilen yöntem dosyasını açın. Sonuç dosyasını gerekli konuma kaydedin ve istendiğinde dosya adını belirtin. Numune büyük hacimli numune döngüsüne enjekte edildikten sonra çalıştır'a basın.
- Saflaştırma yönteminin çalıştırılması
- Kaydedilen yöntemi seçin ve cihaz yazılımı tarafından istendiğinde çalıştır'a tıklayın (adım 1.2.5).
not: Sistem aşağıdaki adımları çalıştıracak şekilde ayarlanmıştır. Cihaz çalışırken kullanıcının herhangi bir şey yapmasına gerek yoktur.
- Sütunu, 2 mL/dk'lık bir akış hızında üç sütun hacmi (CV) dengeleme tamponu ile dengeleyin. Kolon dengelendikten sonra, sistem, büyük hacimli numune döngüsünü kullanarak, numuneyi 1 mL/dk'lık bir akış hızında kolona enjekte edecektir.
- 280 nm'de UV sinyalindeki bir düşüş, numunenin yüklemesinin bittiğini gösterir. Kolonu dengeleme tamponu ile UV sinyali 25 mAU'nun altına düşene kadar 2 mL/dk akış hızında yıkayın.
- 2 mL / dak'lık bir akış hızında ikincil bir yüksek tuzlu yıkama gerçekleştirmek için pH 7.5'te 1 M NaCl ile 25 mM Tris'lik dört CV kullanın. Sistem fraksiyon toplayıcısı, tuz yıkama sırasında kolondan çıkan herhangi bir proteini / DNA'yı 50 mL'lik tüplerde toplayacaktır.
- Antikoru kolondan çıkarmak için 1 mL / dak'lık bir akış hızında beş CV elüsyon tamponu uygulayın. Elüatı UV sinyaline dayalı olarak 15 mL'lik tüplerde toplayın; UV 280 sinyali 35 mAU'nun üzerinde olduğunda toplama başlar; sinyal 50 mAU'nun altına düştüğünde toplama sona erer; Buna tepe kesme denir.
not: Tepe kesme, elüsyon profillerinin normalizasyonunu sağlar ve protein agregaları içerebilen elüsyon pik kuyruğunu önler.
- Sütunu üç CV dengeleme tamponu kullanarak yıkayın. Yıkama adımından sonra çalışma sona erer.
- Elüsyondan sonra, saflaştırılmış proteini 1 M Tris bazı kullanarak ~ 5.5 pH'a kadar hemen nötralize edin. Protein konsantrasyonunu 280 nm ve 260 nm'de bir mikrohacimli UV-Vis spektrofotometresi kullanarak ölçün ve 4 °C'de saklayın.
