Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
>BÖLÜM 1: Ayrışmış, fetal, kemirgen hipokampal nöronal kültürlerin kurulması
>1. Hazırlık adımları
- Kaplama yüzeylerinin Poli-L-Lizin (PLL) kaplaması (diseksiyondan 3 gün önce)
- 500 mL damıtılmış suya 2.38 g borik asit ve 1.27 g boraks ekleyerek ve eriyene kadar 15 dakika karıştırarak borat tamponunu hazırlayın. Bir kaputun altında, tampon çözeltisini filtreleyerek (0,2 μm gözenek boyutu) sterilize edin, etiketleyin ve oda sıcaklığında (RT) saklayın.
not: Bu çözüm stabildir ve 6 ay boyunca kullanılabilir.
DİKKAT: Borat tamponu hazırlarken, önerilen kişisel koruyucu ekipman kullanın.
- 10 mL damıtılmış suya 1 g PLL ekleyerek ve eriyene kadar karıştırarak PLL stok çözeltisini (100 mg / mL) hazırlayın. 500 μL alikot PLL stok çözeltisi hazırlayın. 1 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için, 50 mL borat tamponuna 500 μL PLL alikot ekleyin ve çözünene kadar döndürün ve çözeltiyi filtreleyerek (0.2 μm gözenek boyutu) sterilize edin.
not: Bu çözelti stabildir ve 6 ay boyunca kullanılabilir.
- Yüzeyleri kaplama için hazırlayın. İmmün boyama prosedürleri için 12 mm çapında lameller ve canlı nöronların görüntülenmesini içerecek çalışmalar için cam tabanlı kaplar kullanın. Lamel kullanıyorsanız, otoklavlayın ve ardından her tabağa (3,5 cm çapında) beş lamel yerleştirin.
not: Lamelin kalınlığı, elde edilen görüntülerin sinyalinin kalitesini ve yoğunluğunu etkiler. Çoğu mikroskop objektifi # 1.5 lameller için tasarlanmıştır. Görüntüleme kurulumuna ve tekniklerine göre uygun lamel seçin.
- Bir kaputun altında, her tabağa 1,5 mL PLL çözeltisi ekleyin (cam tabanlı tabak veya beş lamel içeren 3,5 cm'lik tabak). Tüm lamellerin suya daldırıldığından ve 24 saat boyunca RT'de saklandığından emin olun.
- Diseksiyondan 2 gün önce, PLL solüsyonunu aspire edin ve steril endotoksin içermeyen su ile yıkayın, lamellerin suya batırıldığından emin olun. Bulaşıklarda su bulundurun ve 24 saat RT'de saklayın.
- Diseksiyondan 1 gün önce, suyu aspire edin ve NB + B27 kültür ortamı ile değiştirin (aşağıya bakınız) ve bulaşıkları 24 saat boyunca 37 ° C'de bir inkübatöre koyun.
- Kültür ortamı ve stok çözeltisinin hazırlanması (diseksiyondan 1 gün önce)
- Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM): L-Glutamin ve fenol kırmızısı içermeyen 500 mL DMEM Yüksek Glikoza (4.5 g / L), 50 mL at serumu, 50 mL fetal sığır serumu (FBS), 10 mL L-glutamin (200 mM), 10 mL sodyum piruvat (100 mM), 10 mL penisilin-streptomisin (10.000 U / mL). Süzün (0,2 μm gözenek boyutu) ve sıkıca kapatılmış bir kapakla 4 oC'de 5 mL'lik alikotlarda saklayın.
not: Bu çözüm stabildir ve 1 ay boyunca kullanılabilir.
- B27 (NB + B27) ile desteklenmiş nörobazal (NB) ortam: Fenol kırmızısı içermeyen 50 mL NB ortamına 1 mL B27 takviyesi ekleyin.
- B27 ile desteklenmiş Hibernate-E ortamı (Hibernate + B27): 50 mL Hibernate-E ortamına 1 mL B27 takviyesi ekleyin.
- Hücre Dışı Fizyolojik Çözelti (EPS): 1 L steril suya, belirtilen son konsantrasyonlarda aşağıdakileri ekleyin: NaCl (140 mM), KCl (3.5 mM), N- (2-Hidroksietil) piperazin-N'- (2-etansülfonik asit) (HEPES, 10 mM), glikoz (20 mM) ve CaCl2 (2 mM). Çözünene kadar karıştırın ve NaOH (0,5 M) veya HCl (0,5 M) ekleyerek pH'ı 7,4'e ayarlayın. Kaputun altında filtreleyerek (0,2 μm gözenek boyutu) sterilize edin ve 4°C'de saklayın.
- Ekipman ve diğer laboratuvar malzemeleri (diseksiyon günü)
- Bir su banyosunu 37 ° C'ye ayarlayın. Aşağıdaki alikotları ısıtın: 50 mL Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ve 5 mL DMEM.
- Mutlak etanol içeren bir behere daldırarak aşağıdaki aletleri sterilize edin (Şekil 1B): forseps, kavisli forseps, makas, ince kavisli forseps, ince düz forseps, ameliyat makası, ince açılı forseps ve hassas yaylı makas.
not: Aletleri korumak için, beherin altına yumuşak bir malzeme (örn. bilim hassas mendilleri) yerleştirin.
- İki tepsiyi buzla doldurun ve aşağıdaki öğeleri yerleştirin.
- Buz tepsisi 1 (Şekil 1C): Cerrahi aletleri mutlak etanollü behere yerleştirin, cerrahi aletleri durulamak için HBSS'li bir behere, embriyoları yerleştirmek için HBSS'li 10 cm'lik bir kaba, embriyoların başlarını yerleştirmek için HBSS'li 6 cm'lik bir kaba ve embriyoların beyinlerini yerleştirmek için Hibernate + B27'li 6 cm'lik bir tabağa yerleştirin.
- Buz tepsisi 2: Diseke hipokampus için 1 mL tripsin% 2.5 alikot ve Hibernate + B3.5 ile 27 cm'lik bir tabak yerleştirin.
not: Bu prosedür için gereken süre, araştırmacının deneyimine ve diseke edilecek embriyo sayısına bağlıdır. Bu nedenle, buz gereken süre boyunca donmuş kalmalıdır. Bu amaç için polistiren tepsiler tavsiye edilir.
2. Diseksiyon ve tohumlama (Şekil 1)
- Hipokampal izolasyon
not: Embriyonik gün 18'de (E18) embriyolu hamile sıçanlara, Barselona Üniversitesi'nin yerel etik komitesine uygun olarak, deney hayvanlarının kullanımı ve bakımı ile ilgili Avrupa (2010/63/UE) düzenlemelerine uygun olarak protokol başlamadan hemen önce ötenazi yapılır. Bu protokolde ötenazi yöntemi olarak karbondioksit (CO2) inhalasyonu kullanılmıştır.
- Forseps ve makas kullanarak fareyi abdominal periton seviyesinde inceleyin. E18 embriyoları ile uterusu çıkarın ve buz üzerinde soğutulmuş 10 cm'lik bir tabağa koyun.
NOT: Sıçan kıllarının embriyolara yapışmasını önlemek önemlidir. Karın sterilize etmek için bol miktarda% 70 etanol kullanılması tavsiye edilir. Bu adımdan itibaren, davlumbazın içinde buz tepsisi 1 üzerinde çalışın.
- Embriyonik keseleri açın ve embriyoları HBSS ile 10 cm'lik çanağa aktarın, embriyoların tamamen daldırıldığından emin olun.
- Embriyo kafasını makasla çıkarın ve HBSS ile 6 cm'lik tabağa yerleştirin. Bu işlemi tüm embriyolarla tekrarlayın.
not: Kontaminasyonu önlemek için, embriyo başları dışındaki tüm dokular vidalı kapaklı bir kaba atılmalıdır.
- Embriyo kafasını ince kavisli forseps ile tutun ve yörüngeleri bir çift ince düz forseps ile delin, 45°'lik bir açıyla girin ve ardından ince kavisli forsepsleri serbest bırakın.
not: Forseps beyinden geçmemelidir, bu nedenle girerken açıyı korumak önemlidir.
- Oksipital kemikten frontal kemiğe kadar cildi ve kafatasını ameliyat makası ile inceleyin. Beyni bir çift ince kavisli forseps ile çıkarın ve Hibernate + B27 ile 6 cm'lik tabağa yerleştirin. Tüm beyinler iyileşene kadar bu işlemi tekrarlayın.
- İnce düz forseps ile telensefalonları sagittal olarak ayırın.
not: Bu adımdan itibaren, hipokampusun diseksiyonu bir stereomikroskop altında gerçekleştirilir. Işığın diseksiyon yüzeyini yanlardan aydınlatması için mafsallı lambaların kullanılması tavsiye edilir. Ayrıca, hipokampusu daha iyi ayırt etmeye izin veren daha fazla kontrast sağladığı için siyah bir arka plan kullanılması önerilir.
- Hibernate + B27 damlalarını 1 cm aralıklarla (örneğin bir daire içinde) yerleştirerek 10 cm'lik bir tabak hazırlayın. Hibernate + B27 damlası başına bir telensefalon yerleştirin ve diseksiyon dürbünü aracılığıyla görselleştirin (1.25x objektif büyütme önerilir).
- Meninksleri dikkatlice soyun ve hipokampusu daha iyi görselleştirmek için talamusu çıkarın.
- Hipokampusu hassas yaylı makasla inceleyin ve buz tepsisi 3.5'deki Hibernate + B27 ile 27 cm'lik tabağa yerleştirin. Tüm hipokampuslar toplanana kadar her telensefalon için tekrarlayın.
- Tüm hipokampusları bir Pasteur pipeti ile dikkatlice toplayın ve 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
not: Tripsini seyreltmemek için hipokampusu toplarken minimum Hibernate + B27 hacmini alın.
- Hücre ayrışması
- Hipokampusun enzimatik ayrışması
- Hipokampus içeren 50 mL'lik tüpe 1 mL% 2.5 tripsin ekleyin ve HBSS ile 5 mL'lik bir hacme getirin. 37 °C'deki su banyosunda 15 dakika inkübe edin.
- Tripsini seyreltmek için 10 mL önceden ısıtılmış HBSS ekleyin ve 37 ° C'de su banyosunda 5 dakika inkübe edin.
- Şimdi mukus kütlesi olarak görünen hipokampusları 1.000 μL'lik bir mikropipet ile 50 mL'lik bir tüpe aktarın, 6 mL önceden ısıtılmış HBSS ekleyin ve 37 ° C'de su banyosunda 5 dakika inkübe edin.
- Hipokampusun mekanik ayrışması
- Kütleyi, minimum hacmi alarak konik tabanlı 2 mL'lik bir tüpe aktarın. 1 mL önceden ısıtılmış DMEM ortamı ekleyin. Peleti 1.000 μL'lik bir mikropipet ile hafifçe yukarı ve aşağı aspire ederek homojenize edin.
not: Kabarcıklar hücreleri parçalayabileceğinden, aspire ederken kabarcık oluşturmaktan kaçınmak çok önemlidir.
- Yukarı ve aşağı aspirasyonu, ucu tüpün konik tabanı ile temas edecek şekilde önceden çekilmiş bir cam pipetle (10x-20x) tekrarlayın. Baloncuk oluşturmaktan kaçının. Bu adımın sonunda, karışım yarı saydam olmalıdır.
- Karışım yarı saydam olacak şekilde homojen bir şekilde karıştırıldıktan sonra, karışımı 37 °C'de 4 mL DMEM ortamı içeren bir tüpe aktarın ve bir cam pipet ile yukarı ve aşağı pipetleyerek homojenize edin.
- Hücre tohumlama
- Hücreleri sayın. Çözeltideki nöron sayısı standart laboratuvar prosedürlerine göre sayılabilir.
not: Antikor tespiti ve kalsiyum aktivitesi için görüntüleme deneylerinde, 3,5 cm'lik bir tabak başına 50.000 hücre konsantrasyonu optimaldir.
- Hücreleri askıda tutarak, hesaplanan hacmi geri çekin ve PLL kaplı lameller içeren 3,5 cm'lik tabaklarda veya PLL kaplı cam tabanlı tabaklarda tabaklayın.
- Çapraz hareketlerle (ileri geri, sonra yan yana; gerektiği kadar tekrarlayın) yumuşak bir şekilde sallayarak hücreleri bulaşıkların üzerine eşit şekilde dağıtın ve bulaşıkları CO2 (% 5) inkübatöre yerleştirin.
not: Hücrelerin yemeğin çevresine yerleşmesini önlemek için çapraz hareketler kullanmak önemlidir.
- Her hafta yaklaşık 1 mL NB + B27 ekleyin, böylece kültür kurumaz.
not: 2 hafta sonra (14 gün in vitro [div]), nöronlar olgunlaşır ve deney için kullanılacak tüm faktörleri ifade eder. Bu protokol kullanılarak elde edilen toplam ortalama nöron sayısı, hamile sıçan başına ortalama 12 E18 embriyosundan gelen yaklaşık 2.5 x10 6 nörondur.
>BÖLÜM 2: Nöronal hücre yüzey proteinlerinde antikor tespiti için hipokampal nöronal kültürlerin kullanılması
>NOT: Protokolün bu kısmı, anti-NMDAR ensefalitli hastaların serumunda ve/veya BOS'unda anti-NMDAR antikorlarını tanımlamak için hipokampal kültürlerin nasıl kullanıldığını göstermektedir. Floresan immün boyama, canlı nöronlardaki reaktiviteyi görselleştirmek için kullanılır, ancak diğer görselleştirme yöntemleri de kullanılabilir. Bu deney için uygun bir kontrol, sağlıklı bir bireyden alınan serum veya BOS olacaktır. İnsan örneklerini kullanırken, kurumsal etik kuruldan onay alınması gerekebileceğini unutmayın.
>3. Canlı floresan immün boyama
- Lameller üzerinde büyütülmüş 14 div hücresi kullanın (beş lamel içeren 3,5 cm'lik tabak başına 50.000 hücre).
- Davlumbazın içinde, lamelleri önceden 37 °C'ye ısıtılmış NB ile durulayın.
- Bu durumda, NB ortamında serum için 1:200 veya BOS için 1:2 oranında seyreltilmiş anti-NMDAR antikorları (birincil antikor olarak kullanılır) içeren numuneyi ekleyin ve 37 °C'de 1 saat inkübe edin (CO2 (% 5) inkübatörün içinde).
- RT'de fosfat tamponlu salin (PBS) 3x ile dikkatlice durulayın.
- Fiksasyon çözeltisi ekleyin (PBS'de% 4 formaldehit) ve RT'de 5 dakika
inkübe edin
Dikkat: %4 formaldehitle çalışırken, davlumbazın içinde çalışın ve önerilen kişisel koruyucu ekipman giyin.
- Her biri 5 dakika boyunca 3x'i PBS ile yıkayın.
- 1:1000 seyreltmede ikincil antikor Keçi anti-İnsan AF488 ekleyin ve RT'de 1 saat
inkübe edin
not: İnkübasyon sırasında alüminyum folyo ile kaplayarak ışığa maruz kalmaktan koruyun.
- Her biri 5 dakika boyunca 3x'i PBS ile yıkayın. Damıtılmış su ile durulayın
- Lamelleri sıvı bir montaj ortamıyla (örneğin, DAPI'li solma önleyici montaj ortamı; yaklaşık 7 μL) monte edin, kalan sıvıyı aspire edin ve damıtılmış su ile durulayın. Nöronlar artık floresan görüntüleme için hazırdır.
Dikkat: Montaj ortamını tutarken, önerilen kişisel koruyucu ekipmanı kullanın.
