Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
>NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm adımlar bir BSL2 davlumbazında gerçekleştirilmelidir. PRN testinde kullanılan optimal RSV konsantrasyonunu belirlemek için bir plak azaltma nötralizasyonu (PRN) testinden önce viral titrasyon gereklidir. Virüs stoklarının, bir kez çözülecek ve her NAb testi için kullanılacak küçük bir hacimde alikot edilmesi önerilir. Bir çalışmadan alınan tüm numuneler için gerçekleştirilen tüm NAb testleri için aynı viral stoğun kullanılması da önerilir. Kültür ortamının ve fosfat tamponlu salinin (PBS) hücre plakalarına eklemeden önce 37 °C'de ısıtıldığından emin olun.
1. RSV Viral Titrasyonu
NOT: Virüs stoklarının sayısına ve kopyaların sayısına bağlı olarak, tahlil plakası Şekil 1'e göre ayarlanabilir. Her virüs stoğu, en yüksek viral konsantrasyondan (yani 1:10) başlayarak tahlil plakasından üç kopya halinde titre edilmelidir. Seri titrasyonlar tipik olarak 1:10 olabilir. A549 hücre kültürü ve bakımı ve RSV kültürü prosedürleri standart prosedürler kullanılarak yapılır ve bu protokole dahil değildir.
- Tohum plakaları (1. Gün)
- Dulbecco'nun Modifiye Eagles ortamında (DMEM) +% 10 fetal buzağı serumu (FCS) + 1000 IU penisilin / streptomisin (kalem / strep) içinde A549 hücrelerini 4 x 105 / mL'de yeniden askıya alın. 4 x 104 A459 hücresi içeren 100 μL/oyuklu 96 oyuklu düz tabanlı steril plakaları tohumlayın.
- Plakaları gece boyunca 37 °C, %5 karbondioksit (CO2) sıcaklıkta inkübe edin (hücreler log fazında büyüyecektir).
not: 23 geçişten sonra yeni bir A549 hücre şişesi kullanın. İlk üç pasajda hala yeni bir hücre şişesi varken deneylere başlanmaması önerilir.
- Virüs enfeksiyonu (2. gün)
- Virüs seri seyreltmesinin hazırlanması
- Tek bir donmuş solunum sinsityal virüsü (RSV) şişesini 37 ° C'lik bir su banyosunda neredeyse tamamen çözülene kadar hızla çözdürün ve hemen buzun üzerine yerleştirin. Test edilecek her RSV virüs stoğu için 3 kopya hazırlayın, 100 μL seyreltilmiş virüs/kuyucuk ile 1:10'luk bir ilk virüs stoğu seyreltmesi kullanın ve negatif kontrol için en az bir sütun ayırın.
NOT: Şekil 1, negatif kontrolü üç kopyalar halinde göstermektedir.
- 96 oyuklu U tabanlı steril bir plakanın A sırasının üç katına 1: 10'da her seyreltilmiş virüsten 100 μL ekleyin. B'den H'ye kadar olan sıralara 90 μL/kuyucuk DMEM + FCS'siz 1000 IU kalem/strep ekleyin.
- 10 μL'yi A satırından B sırasına aktararak plakadan aşağı seri 1:10 seyreltmeler gerçekleştirin. İçeriği 5 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek çözeltiyi karıştırın ve H sırasına kadar on kat seyreltmeye devam edin. Son 10 μL'yi, her bir oyuktaki nihai hacim 90 μL olacak şekilde atın.
NOT: Her seyreltme için yeni uçlar kullanmak önemlidir.
- A549 hücrelerine virüs aşılaması
- Önceki gün hazırlanan A549 hücre plakalarını alın. 549 oyuklu plakalardaki A96 hücre tek katmanlarının ~% 80 birleşik olduğundan emin olun. Plakayı nazikçe ters çevirerek ve steril emici bir kağıt havlu üzerine hafifçe kurulayarak ortamı atın.
- Tüm kuyucukları 100 μL PBS ile iki kez yıkayın; plakayı nazikçe ters çevirerek ve her yıkamadan sonra steril emici bir kağıt havlu üzerine hafifçe lekeleyerek fazla PBS'yi atın. Plakaların kurumasına izin vermeyin.
- Virüs seyreltmelerini viral titrasyon plakasından (Şekil 1) A549 hücre plakasındaki karşılık gelen kuyucuklara aktarın. Plakayı 37 ° C'de,% 5 CO2'de 1 saat inkübe edin. 1 saatlik inkübasyondan sonra, süpernatantları bir pipet kullanarak boşaltın (çapraz kontaminasyonu önlemek için). 90 μL / kuyu çıkarın.
- Her oyuğa 100 μL 1x orta 199 (M199, Malzeme Tablosuna bakınız) + %1.5 karboksimetilselüloz sodyum tuzu (CMC) düşük viskozite + kalem/strep içeren %2 FCS ekleyin.
NOT: 2x M199 + %4 FCS + %2 kalem/strep ve %3 CMC solüsyonları hazırlanmalı ve ileride kullanılmak üzere 4 °C'de saklanmalıdır. Plakalara eklemeden önce çözeltinin 37 °C'de ısıtıldığından emin olun.
- 2x M199 çözeltisi hazırlayın: 1 poşet / 500 mL damıtılmış su + 20 mL FCS + 10 mL kalem / strep (2x MI99 oluşturmak için). Çözeltiyi 0,22 μm'lik bir filtre ünitesi kullanarak filtreleyin.
- % 3 CMC hazırlamak için, 500 mL damıtılmış suya yavaşça 15 g CMC ekleyin. CMC'yi 50 °C'de metalik bir karıştırıcı ısıtıcı kullanarak suda çözün, bu da hazırlanması yaklaşık 1 saat sürer. % 3 CMC yapmak için iyice karıştırın ve çözeltiyi otoklavlayın.
NOT: CMC katısının çözünmesi için suya eklenmesi gerekir; Kuru katıya su eklemek, çözülmesi çok zor olan bir katı "yığını" oluşturur.
- Adım 1.2.2.4.2'de hazırlanan 2x M199 ve %3 CMC'yi 1:1 karıştırarak 1x M199 + %1,5 CMC düşük viskozite + %2 FCS içeren kalem/strep hazırlayın.
- Plakayı 37 ° C'de,% 5 CO2'de 3 gün inkübe edin.
- Tahlil plağı geliştirme ve analiz (5. Gün)
- Fiksasyon ve test plağı geliştirme
- Plakayı nazikçe ters çevirerek M199 + CMC + %2 FCS içeren kalem/streptokok atın. Hücreleri sabitlemek için yavaşça (hücre tabakasını rahatsız etmemek için) 200 μL fiksasyon tamponu (%80 aseton, %20 PBS, -20 °C'de saklanır) ekleyin. -20 °C'de 20 dakika inkübe edin.
- Sabitleme tamponunu atın ve emici bir kağıt havlu üzerine nazikçe kurulayın. Plakayı yüzü aşağı bakacak şekilde 10 dakika kurumaya bırakın.
not: Bu adımdan itibaren tahlil, BSL2 davlumbazının dışında gerçekleştirilebilir.
- % 0.05 polisorbat 20 içeren filtrelenmiş PBS'de% 5 süt seyreltici engelleme çözeltisi hazırlayın (PBS-polisorbat, Malzeme Tablosuna bakınız). 200 /kuyucuk ve 110 kuyuya dayalı olarak bir plaka için blokaj için gereken hacmi hesaplayın: 200 μL/kuyu x 110 kuyucuk = 22 mL (20,9 mL filtrelenmiş PBS-polisorbatta 1,1 mL konsantre süt seyreltici). Bu aşamada, primer ve sekonder antikorlar için de yeterli bloke edici solüsyon oluşturun. 50 μL/kuyucuk ve 110 kuyucuk dayalı bir plaka için her bir antikor çözeltisi için gereken hacmi hesaplayın: 50 μL/kuyucuk x 110 kuyucuk = 5.5 mL. Bu nedenle, tek bir plaka tahlili için gerekli olan süt seyreltici bloke edici çözeltisinin toplam hacmi 33 mL'dir.
- 200 μL / kuyu blokaj çözeltisi ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında (RT) 30 dakika inkübe edin. Plakayı nazikçe ters çevirerek çözeltiyi atın ve emici bir kağıt havlu üzerine kurulayın.
- Bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş 1:500 Keçi X RSV antikoru (mAb – birincil antikor) hazırlayın. 50 μL/kuyucuk mAb çözeltisi ekleyin ve 37 °C'de 1 saat inkübe edin. Plakayı filtrelenmiş PBS-polisorbat ile 3 kez yıkayın.
- Bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş 1: 5.000 Alexa-Fluor eşek anti-keçi IgG (ikincil antikor) hazırlayın. İkincil antikor çözeltisinden 50 μL / kuyu ekleyin ve 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Plakayı filtrelenmiş PBS-polisorbat ile 5 kez yıkayın.
- Şekil 2'de gösterildiği gibi floresein izotiyosiyanat (FITC) kanalını ve sayım ayarlarını kullanarak plakayı otomatik bir spot okuyucuda okuyun. Plakayı folyoya sarın ve 4 °C'de saklayın. Kullanılmayan 96 oyuklu bir kültür plakası kullanarak cihazı kalibre edin ve testten önce sayım ayarlarını girin.
not: Gerekirse birkaç gün içinde yeniden tarama yapmak mümkündür. Kalibrasyon ve sayım ayarı, tahlilde kalibrasyon için kullanılan aynı tip plakayı kullanıyorsa, gelecekteki taramalar için kaydedilebilir ve kullanılabilir.
- Artefakt plaklar veya bozulmuş hücre tek katmanları için kuyucukların görüntülerini kontrol edin (Şekil 3). Bozulmuş hücre tek katmanlarına sahip kuyuları hariç tutun.
not: Artefakt plaklarının boyutuna bağlı olarak, bu kuyular için manuel sayımlar yapılması gerekebilir veya bu kuyuların veri analizinden atılması gerekebilir. Geçerli bir sonuç için kriterler arasında, birden fazla replike kuyuda tespit edilen bozulmuş hücre tek tabakası veya artefakt plakları ve negatif kuyucuklarda (virüs eklenmemiş kuyucuklar) tespit edilen plak oluşturan birimler (PFU) yer almaz.
- Viral konsantrasyonları belirleyin
- Noktaların net bir şekilde sayılabileceği son iki seyreltmeyi seçin. Aynı seyreltmede tekrarlanan kuyulardan ortalama nokta sayısını hesaplayın. Aşağıdaki formülü kullanarak stok numunesinin viral titresini (mL başına PFU) hesaplayın:
PFU/mL = Ortalama plak sayısı/(Seyreltme faktörü × Kuyuya eklenen seyreltilmiş virüs hacmi)
not: Her RSV stoğu için belirlenen virüs konsantrasyonu artık PRN testinde kullanılabilir (adım 2).
2. RSV Nötralizasyon Testi
- Tohum plakaları (1. Gün)
- A549 hücrelerini DMEM +% 10 FCS + 1000 IU kalem / strep'te 4 x 105 / mL'de yeniden askıya alın. 4 x 104 A459 hücresi içeren 100 μL/oyuklu 96 oyuklu düz tabanlı steril plakaları tohumlayın ve plakaları gece boyunca 37 °C, %5 CO2'de inkübe edin (hücreler log fazında büyüyecektir).
not: 23 geçişten sonra yeni bir A549 hücre şişesi kullanın. 3 numaralı geçişten önce A549 hücrelerinin kullanılması önerilmez.
- Virüs ve serum hazırlama (2. Gün)
not: Numune tipine bağlı olarak, NAb testinden önce numunelerin ön işlenmesi için gerekli adımlar vardır. Ulusal Biyolojik Standartlar ve Kontroller Enstitüsü'nden (NIBSC) talep üzerine temin edilebilen RSV uluslararası standart serumlarının kullanılması tavsiye edilir.
- Serum seyreltmesinin hazırlanması
- İnsan RSV referans antiserumunu (referans serum, REF) ve serum test örneklerini RT'de çözün. Kullanmadan önce serum örneklerini ve referans antiserumu 56 ° C'de 30 dakika boyunca bir su banyosunda ısıyla inaktive edin. Seyreltmeleri plaka şablonuna göre hazırlayın (Şekil 4).
- REF'in 1:100 oranında seyreltilmesini hazırlayın. Test plakası başına FCS olmadan DMEM + kalem/strep içinde seyreltilmiş en az 110 μL REF hazırlayın (ör., toplam 150 μL hacimde 1,5 μL REF). 96 oyuklu U-tabanlı steril bir plakanın A12 kuyusuna 110 μL 1:100 seyreltilmiş REF ekleyin.
- Sütun 12'deki B12 ila H12 kuyularına FCS'siz 55 μL DMEM + kalem / strep ekleyin. 55 μL'yi A satırından B satırına aktararak, içeriği 5 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek çözeltiyi karıştırarak ve H satırına kadar devam ederek plakadan aşağı seri 1: 2 seyreltme gerçekleştirin. Her bir oyuktaki son hacim 55 μL olacak şekilde son 55 μL ortamı atın. Her seyreltme için yeni uçlar kullanın.
- Serum test numunelerinin 1:100 seyreltmesini hazırlayın. Tüm serum numuneleri üç nüsha halinde test edildiğinden, serum test numunesi başına minimum 110 μL / kuyucuk x 3 = 330 μL hacim hazırlayın.
- Her seyreltilmiş serum test örneğinden 110 μL ekleyin (1:100; S1 = serum 1, S2 = serum 2, vb.) Şekil 4'e göre 96 oyuklu steril plakanın A1 ila A9 arasındaki ilgili kuyularına ve ayrıca E1 ila E9'a.
- X etiketli tüm kuyucuklara FCS'siz 55 μL DMEM + kalem/strep ekleyin. D satırına kadar (numune 1, 2 ve 3 için) adım 2.2.1.3'e göre seri 1:2 seyreltmeler gerçekleştirin. Son 55 μL ortamı, her bir oyuktaki son hacim 55 μL olacak şekilde atın. Benzer şekilde, E ila H.
sıraları için 4, 5 ve 6 numaralı numuneler için seri 1:2 seyreltmelerini gerçekleştirin
not: Her seyreltme için yeni uçlar kullanmak önemlidir.
- Sütun 10 ve 11'deki kuyucuklara FCS'siz 55 μL DMEM + kalem / strep ekleyin.
- Virüsün hazırlanması
- Tek bir donmuş RSV şişesini 37 ° C'lik bir su banyosunda neredeyse tamamen çözülene kadar hızla çözün ve hemen buzun üzerine yerleştirin.
- Adım 1.3.2'de belirlenen RSV alikotunun konsantrasyonuna bağlı olarak virüsü FCS olmadan DMEM + kalem / strep içinde seyreltin. Yaklaşık 200 PFU/kuyu veren bir seyreltme uygulayın. Toplam 5.5 mL'lik bir hacim hazırlayın (100 kuyu için).
- Virüs-serum karışımının hazırlanması
- Plaka şablonuna göre 1-9 numaralı sütunların tüm kuyucuklarına ve 10 ve 11 numaralı sütunların E-H sıralarının kuyucuklarına (pozitif kontrol) 55 μL seyreltilmiş virüs ekleyin (Şekil 4).
- Sütun 10 ve 11'in AD satırlarının tüm kuyucuklarına FCS'siz 55 μL DMEM + kalem / strep ekleyin (negatif kontrol). Plakayı 37 ° C'de,% 5 CO2'de 1 saat inkübe edin.
- A549 hücrelerine virüs aşılaması
- Kuluçka süresinin tamamlanmasından önce, adım 2.1.1'de hazırlanan A549 hücre plakalarını alın. 549 oyuklu plakalardaki A96 hücre tek katmanlarının ~% 80 birleşik olduğundan emin olun.
- Plakayı nazikçe ters çevirerek ve steril emici bir kağıt havlu üzerine hafifçe kurulayarak ortamı atın. Tüm kuyucukları 100 μL PBS ile iki kez yıkayın, plakayı nazikçe ters çevirerek ve her yıkamadan sonra steril emici bir kağıt havlu üzerine hafifçe lekeleyerek fazla PBS'yi atın. Plakaların kurumasına izin vermeyin.
- Virüs-serum karışımının 100 μL / oyuğunu, plaka şablonunu takip ederek A549 hücre plakasındaki ilgili kuyucuklara aktarın. Plakayı 37 ° C'de,% 5 CO2'de 1 saat inkübe edin.
- 1 saat sonra, bir pipet kullanarak 90 μL/kuyucuk çıkarın ve 100 μL önceden ısıtılmış 1x M199 +% 1.5 CMC +% 2 FCS + kalem / strep ekleyin. Plakayı 37 °C'de 3 gün inkübe edin, %5 CO2.
not: Plakalara eklemeden önce çözeltinin 37 °C'de ısıtıldığından emin olun.
- Tahlil plağı geliştirme ve analiz (5. Gün)
- 1.3.1.1 ila 1.3.1.8 arasındaki adımları izleyerek fiksasyon ve test plakası geliştirin.
- % 50 nötralizasyon titresini belirleyin
- 'Serumsuz' kontrol kuyucuklarının %50'sinin üstündeki ve altındaki karşılıklı serum seyreltmeleri arasındaki oransal mesafeyi hesaplayarak %50 nötralizasyon titresini belirleyin (pozitif virüs kontrolü - sütun 10, satır E-H).
- Serum kuyucuklarında ve serum kontrol kuyucuklarında bireysel viral enfeksiyonlardan kaynaklanan PFU (yani plaklar) sayısını sayın. Serum kontrol kuyucuğunun ortalama PFU sayısını hesaplayın ve %50 değerini belirleyin.
- Serum kontrol kuyucuklarının% 50 değerinin hemen üstünde ve altında sayımlarla serum dilüsyonlarını tanımlayın. Bir yarı log grafiği veya elektronik tablo şablonu kullanarak, x ekseninde (doğrusal ölçek) PFU sayısını ve y ekseninde (log10 ölçeği) karşılıklı serum seyreltmesini çizin. İki nokta arasına bir çizgi çizin ve bu çizgiden test serumu örneklerinin% 50 nötralizasyon titrelerini okuyun.
