$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Tampon Hazırlama
- Etiketleme tamponu (2x fosfat tamponlu salin, (PBS), pH 7.9): 400 mL damıtılmış deiyonize (DD) suya 100 mL 10x PBS ekleyin, sodyum hidroksit (NaOH) ile pH'ı 7.9'a ayarlayın.
- 3 mM Biotin: 1 mg Biotin'i 588 μL etiketleme tamponunda çözün.
- 3 mM Sülfo-etiket: 150 nmol Sülfo etiketini 50 μL etiketleme tamponunda çözün.
- Antijen tamponu (% 5 BSA): 500 mL 1x PBS'ye 25 g Sığır Serum Albümini (BSA) ekleyin.
- 0,5 M asetik asit çözeltisi hazırlayın.
- 1.0 M Tris-HCl tamponu pH 9.0: 1 M Tris-HCl tamponu hazırlayın ve HCl ile pH'ı 9.0'a ayarlayın.
- Kaplama tamponu (%3 Engelleyici A): 500 mL 1x PBS'ye 15 g Bloker A ekleyin.
- Yıkama tamponu (% 0,05 Tween 20, PBST): 5000 mL 1x PBS'ye 2,5 mL Tween 20 ekleyin.
- Okuma tamponu (yüzey aktif madde ile 2x Okuma Tamponu T): 500 mL DD suya, 500 mL Yüzey Aktif Madde ile 4x Okuma Tamponu T ekleyin (Malzeme Tablosu).
- Biotin ve Sulfo-tag'ı -20 °C dondurucuda saklayın.
not: Hem Biotin hem de Sulfo-tag çözeltileri, etiketleme prosedüründen hemen önce her zaman taze olarak hazırlanmalıdır.
2. İnsan Adacığı Otoantijenini Biotin ve Sulfo-tag ile etiketleyin
NOT: Daha verimli bir etiketleme reaksiyonu için ≥0,5 mg/mL'lik yüksek bir antijen konsantrasyonu önerilir.
- Biotin ve Sulfo-tag için insan adacık otoantijeninin molar oranını belirleyin.
- Antijen ağırlığını molekül ağırlığına bölerek antijen molar sayısını elde edin.
- Daha küçük moleküler ağırlığa (≤10 kd) sahip antijen için 1:5 molar oranı ve daha büyük moleküler ağırlığa (>50 kd) sahip antijen için 1:20 molar oranı kullanın.
- Molar sayıyı konsantrasyonuna bölerek Biotin veya Sulfo-tag hacmini hesaplayın.
- İnsan adacık otoantijenini 1: 5.
molar oranıyla Biotin veya Sulfo-tag ile karıştırın
not: Tris veya glisin tampon sistemlerindeki protein, boyutlandırma spin sütunu kullanılarak pH 7.9 ile 2x PBS tamponuna değiştirilmelidir.
- Biotin ve Sulfo-tag ışığa duyarlı olduğundan, reaksiyon tüplerini alüminyum folyo ile kaplayın. Reaksiyonu oda sıcaklığında (RT) 1 saat inkübe edin.
- İnkübasyon sırasında, kolona üç kez 2x PBS tamponu dağıtarak spin kolonunu astarlayın. Çözeltiyi her seferinde 2 dakika boyunca 1000 x g'da santrifüjleyin.
not: Şu anda, köprüleme yoluyla etiketleme reaksiyonu hala devam etmektedir ve durdurulması gerekmektedir.
- Etiketli insan adacık otoantijenini saflaştırarak etiketleme reaksiyonunu durdurun. Saflaştırmak için, otoantijeni spin kolonundan geçirin ve kolonu 2 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüjleyin.
- Antijen proteini miktarını ve nihai hacmi kullanarak etiketli antijen konsantrasyonunu (μg/μL) belirleyin.
not: Kabaca, her spin kolonu geçişinden sonra etiketli antijenin% 90 - 95 oranında tutulması olacaktır.
- Etiketli antijeni ayırın ve etiketli antijeni -80 °C'de saklayın.
3. Test için etiketli iki antijen için en iyi konsantrasyonları ve oranları tanımlayın (kontrol tahtası testi)
- Her biri için toplam hacmi 200 μL olan biri yüksek pozitif diğeri negatif olmak üzere iki serum örneği hazırlayın.
- 4 μL serumu alın ve 96 oyuklu bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) plakası için son hacim oyuk başına 20 μL olana kadar 1x PBS ekleyin. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, yüksek pozitif numune için bir plakanın yarısını ve negatif numune için diğer yarısını kullanın.
- 10 μL Biotin ve 10 μL Sulfo-tag etiketli antijen ekleyin ve Şekil 1A'da gösterildiği gibi iki farklı etiketli antijen için seri seyreltmeler gerçekleştirin. Bir etiketli antijen için yatay bir seri seyreltme ve diğer etiketli antijen için dikey bir seri seyreltme çalıştırın.
- 5.3 ila 9.1'de açıklanan test adımlarının geri kalanına devam edin.
- Yüksek pozitif numuneden gelen sinyallerin, Şekil 1B'de gösterilen negatif numuneden gelen karşılık gelen sinyallerin her birine karşı oranını hesaplayın.
- Pozitif-negatif oranının en yüksek veya en yüksek olduğu bir noktayı seçerek Biotin ve Sulfo-tag etiketli antijenler için en iyi konsantrasyonları belirleyin. Oranı belirlemek için negatif örnekten gelen düşük arka plan sinyalini göz önünde bulundurun.
not: Test Günü 1, Adım 4 ila Adım 6'yı içerir.
4. Doğru biyotin/sülfo etiketi etiketli antijen konsantrasyonunu kullanarak antijen tamponunu hazırlayın
- Kontrol tahtası testine dayalı olarak her bir antijenin rasyonel konsantrasyonunu seçin.
- Antijen tamponu için Biotin / Sulfo-tag etiketli antijenin rasyonel konsantrasyonunu kullanarak plaka başına 3 mL antijen çözeltisi hazırlayın.
5. Serum Örneklerini Etiketli Antijenle İnkübe Edin
>NOT: Bu bölümde biri serum asit tedavisi olmayan, diğeri serum asit tedavisi olan iki protokol bulunmaktadır. İnsülin otoantikoru (IAA) testi dışındaki tüm adacık otoantikor testleri, adım 5.1'den 5.5'e kadar serum asidi tedavisi olmadan düzenli protokol kullanırken, IAA testi bu adımları atlar ve adım 5.6'dan 5.9'a kadar serum asidi tedavisi ile protokolü kullanır.
- 4 μL serumu alın ve 96 oyuklu bir PCR plakası için son hacim oyuk başına 20 μL olana kadar 1x PBS ekleyin.
- Kuyucuk başına 20 μL etiketli antijen çözeltisi ekleyin.
- Işıktan kaçınmak için PCR plakasını sızdırmazlık folyosu ile örtün.
- Plakayı 2 saat boyunca RT'de bir çalkalayıcıya (düşük hızda) koyun.
- Plakayı 4 °C buzdolabına koyun ve gece boyunca (18 - 24 saat) inkübe edin.
not: 5.6'dan 5.9'a kadar olan adımların aşağıdaki protokolü yalnızca IAA testi için tasarlanmıştır ve diğer otoantikor testleri bu adımları atlar.
- Her serum örneği için 15 μL serumu 18 μL 0.5 M asetik asit ile karıştırın. Bu karışımı RT'de 45 dakika inkübe edin.
- Antijen çözeltisini, antijen tamponu kullanarak, kontrol tahtası testine dayalı olarak, Biotin ve Sulfo-tag etiketli antijenin rasyonel konsantrasyonu ile hazırlayın. Her oyukta, Biotin ve Sulfo-tag etiketli antijen içeren 35 μL antijen tamponunu yeni bir PCR plakasına alikotlayın.
- 45 dakikalık inkübasyon (adım 5.6) adımı tamamlanmadan önce, antijen plakası üzerindeki her bir oyuğun yanına 8.3 μL 1 M Tris pH 9.0 tamponu ekleyin (adım 5.6). Tris tamponu ve antijen arasındaki karışımı sınırlamak önemlidir. Asitle muamele edilen serumun 25 μL'sini 5.6. adımda hemen her bir oyuğa aktarın ve çözeltiyi çalkalayın. Işıktan kaçınmak için PCR plakasını sızdırmazlık folyosu ile örtün.
- Plakayı 2 saat boyunca RT'de bir çalkalayıcıya (düşük hızda) koyun. Plakayı 4 °C buzdolabına koyun ve plakanın gece boyunca (18 - 24 saat) inkübe edilmesine izin verin.
6. Streptavidin Plakasını Hazırlayın
- 4 °C buzdolabından bir streptavidin plakası alın ve plakanın RT'ye gelmesine izin verin.
- Streptavidin plakası RT'ye geldiğinde, her oyuğa 150 μL% 3 Bloker A ekleyin.
- PCR plakasını sızdırmazlık folyosu ile örtün.
- Plakayı gece boyunca 4 °C buzdolabında inkübe edin.
NOT: Test Günü 2, Adım 7 ila Adım 9'u içerir.
>7. Serum / Antijen İnkübatlarını Streptavidin Plakasına Aktarın
- Ertesi gün, streptavidin plakasını buzdolabından çıkarın ve tamponu plakadan atın. Masanın üzerine biraz kuru kağıt havlu koyun ve kuyucukların içinde tampon kalmayana kadar tabağı baş aşağı vurun.
- Boş streptavidin plakasını oyuk başına 150 μL PBST ile doldurun ve PBST'yi toplam üç yıkama için plakadan atın.
- Her kuyu başına 30 μL serum / antijen inkübatlarını streptavidin plakasına aktarın.
- Işıktan kaçınmak için plakayı folyo ile örtün. Plakayı düşük ayarda RT'de 1 saat çalkalayın.
8. Plakayı yıkayın ve okuma arabelleği ekleyin
- Kuluçka makinelerini plakadan atın. Oyuk başına 150 μL PBST ekleyin ve toplam üç yıkama için PBST'yi plakadan atın.
- Yıkadıktan sonra, Okuma tamponu kuyusu başına 150 μL ekleyin.
not: Çözeltide hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek önemlidir çünkü bu, plakanın plaka okuyucu makinesinde nasıl okunduğunu etkileyecektir.
