İmmünoglobulin G'nin Tespiti için Kağıt Tabanlı Bir İmmünoassay

Özet

Kaynak: Peng, Y. et al., Antikorların Selüloz Kağıt Disklere Kovalent Bağlanması ve Çıplak Gözle Kolorimetrik İmmünoanalizlerdeki Uygulamaları.J. Vis. Uzm. (2016)

Video, glutaraldehit ile çapraz bağlanmış amin ile işlevselleştirilmiş selüloz diskleri içeren kağıt bazlı bir immünolojik testi göstermektedir. IgG-Fc'ye özgü yakalama antikorlarının kovalent immobilizasyonu, ardından immünoglobulin G ve yaban turpu peroksidaz konjuge tespit antikorlarının eklenmesi, immünoglobulin G'nin varlığını doğrulayan bir renk değişikliği ile sonuçlanır.

Protokol

1. Amin Fonksiyonel Gruplarının Selüloz Kağıt Diskler Üzerine Aşılanması

1. 1 cm × 1 cm boyutlarında bir parça kare kağıt ve bir delgeç kullanarak 6,0 mm çapında 1 numaralı selüloz kağıttan (orta akışlı filtre kağıdı) yapılmış 100 kağıt disk hazırlayın.
2. Kağıt diskler üzerinde -NH₂ grupları elde etmek için çeker ocakta 50 ml'lik bir cam şişede 1 ml 3-aminopropiltrimetoksisilan (APS) ve 10 ml asetonu karıştırın. Taze hazırlanmış APS reaktif karışımına kağıt diskler ekleyin ve oda sıcaklığında orbital karıştırma (200 rpm) ile 5 saat inkübe edin.
   Dikkat: Çeker ocakta APS ve asetonu kullanın.
3. Fazla çözeltiyi 50 ml'lik cam şişeden organik bir atık kabına boşaltın.
4. Cam şişeye 10 ml aseton ekleyin, iyice karıştırın ve reaksiyona girmemiş APS ve diğer safsızlıkları gidermek için tamamen boşaltın. Bu adımı iki kez tekrarlayın.
5. Kağıt diskleri kağıt havlu üzerine yayın ve 110 °C fırında 3 saat pişirin. Kağıt diskleri soğumaya bırakın. Diskleri oda sıcaklığında 50 ml'lik bir santrifüj tüpünde saklayın.
6. Aşağıda açıklandığı gibi selüloz kare kağıt üzerindeki amin gruplarının aşılanmasını kontrol etmek için Fourier dönüşümü kızılötesi spektroskopisini (FTIR) kullanın (Şekil 1A).
   1. Bilgisayarı açın ve FTIR spektroskopi cihazını açın.
   2. FTIR spektroskopisi için yazılımı açın.
   3. 'Ölçüm → Başlat'a gidin. 'BS: KBr', 'Lamba: Kızılötesi' ve 'Lazer' dikdörtgenleri, başlatma tamamlandığında yeşile dönecektir.
   4. Dikdörtgenlerin altındaki 'Veri'yi seçin ve 'Ölçüm Modu', 'Apodizasyon', 'Tarama Sayısı', 'Çözünürlük' ve 'Aralık (cm-1)' için '%Transmittance', 'Happ-Genzel', '45', '4.0' ve 'Min: 400, Max: 4000' öğesini seçin.
   5. 'Ölç'e tıklayın.
   6. Arka plan verileri için 'Veri dosyası'nı seçin. Yorumları yazın.
   7. Arka planın taban çizgisini almak için 'BKG'yi tıklayın.
   8. Kare kağıdı film numune tutucusuna sabitleyin.
   9. Örnek veriler için 'Veri dosyası'nı seçin. Yorumları yazın.
   10. Numunenin spektrumlarını elde etmek için 'Numune'ye tıklayın.
   11. FTIR spektroskopi uygulamasını kapatın ve bilgisayarı kapatın.
7. Amin ile işlevselleştirilmiş kalite No. 113 selüloz kare kağıt ve diskleri (hızlı akışlı filtre kağıdı) hazırlamak için yukarıdaki adımları tekrarlayın (adım 1.1 ila 1.6) ve kalite No. 113 kare kağıt için FTIR spektrumlarını elde edin (Şekil 1B).

2. İmmünoglobulin G (IgG) Tespiti için Kağıt Bazlı Enzime Bağlı İmmünosorbent Testi (ELISA)

1. 20 ml'lik bir cam şişeye 5 ml% 0.05 glutaraldehit çözeltisi (50 mM PBS tamponunda hazırlanmış, pH 7.4) ekleyin. 15 amin işlevli orta akışlı filtre kağıdı diskini bu çözeltiye daldırın ve oda sıcaklığında çalkalayarak 1 saat bekletin.
   1. Aynı zamanda, başka bir 15 aldehit işlevselleştirilmiş hızlı akışlı filtre kağıdı diski hazırlamak için Adım 2.1'i tekrarlayın.
      Dikkat: Çeker ocakta glutaraldehiti tutun.
2. Kağıt disklerden reaksiyona girmemiş glutaraldehiti çıkarmak için, 15 orta akışlı filtre kağıdı diskini 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne ve 15 hızlı akışlı filtre kağıdı diskini başka bir 15 ml'lik santrifüj tüpüne yerleştirin. Her tüpe 5 ml DI su ekleyin ve tüpleri 10 saniye çalkalayın. Bir pipet ile aspire ederek suyu çıkarın. Reaksiyona girmemiş glutaraldehiti çıkarmak için iki kez tekrarlayın.
3. Kağıt diskleri 37 °C fırında kurutun.
4. Orta akışlı ve hızlı akışlı filtre kağıdı disklerinin her birine sırasıyla 5 μl ve 8 μl 0.025 mg / ml fare IgG-Fc fragman antikoru ekleyin ve 20 dakika inkübe edin.
5. Antikorları çıkarmadan her bir kağıt diske 10 μl 50 mM PBS (pH 7.4) ekleyin ve amin aldehit reaksiyonu için 40 dakika inkübe edin.
6. Kağıt diskleri bir kağıt havlunun üzerinde 0,2 ml yıkama tamponu ile yıkayın. Yıkamayı üç kez tekrarlayın.
7. Kağıt diskleri 37 °C'lik bir fırında kurutun.
8. Kağıt diskleri 15 μl blokaj tamponu ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bloke edin.
9. Her bir kağıt diski 0,2 ml yıkama tamponu ile bir kağıt havlunun üzerinde yıkayın. Yıkamayı üç kez tekrarlayın.
10. IgG standartlarını çalıştırın.
    1. Her diske üç kopya halinde 10 μl çeşitli IgG konsantrasyonları (örneğin, PBS'de 0, 10, 125, 250 ve 500 ng / ml) yükleyin. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
11. Kağıt diskleri bir kağıt havlunun üzerinde 0,2 ml yıkama tamponu ile yıkayın. Yıkamayı üç kez tekrarlayın.
12. 10 μl HRP konjuge fare IgG-Fc fragman antikorları (1: 10.000, 10 mM PBS, pH 7.4) yükleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
13. Kağıt diskleri bir kağıt havlunun üzerinde 0,2 ml yıkama tamponu ile yıkayın. Yıkamayı üç kez tekrarlayın.
    not: Sonuçlar tamponun varlığından etkilenmediği için yıkama tamponunun çıkarılmasına gerek yoktur.
14. Her diske 10 μl'lik bir TMB ve hidrojen peroksit karışımı yükleyin.
15. 5 dakikalık inkübasyondan sonra dijital kamera veya akıllı telefon ile tüm kağıt disklerin görüntülerini çekin.
    not: Şekil 2A'da '0', yakalama antikoru immobilizasyonu ile tedavi edilen kağıt diskleri ve IgG serumu içermeyen antikor-HRP/TMB çözeltisini ifade eder.
16. Görüntüdeki her bir kağıt diskin yoğunluğunu Görüntü J ile analiz edin.
    1. Adım 3.15'te çekilen görüntüleri '.tif' formatına dönüştürün.
    2. 'Image J' yazılımını açın.
    3. 'Dosya → Aç'a gidin, analiz edilecek görüntüyü seçin.
    4. 'Oval' şekil düğmesini seçin.
    5. 'Görüntü → Türü → 32 bit'e gidin.
    6. 'Düzenle → Ters Çevir'e gidin.
    7. "Analiz Et → Ölç"e gidin.
    8. Bir elektronik tablodaki verileri kopyalayın ve analiz edin.

Sonuçlar

Şekil 1.İşlenmemiş ve APS ile işlenmiş orta akışlı filtre kare kağıdının (A) ve hızlı akışlı filtre kare kağıdının (B) Fourier dönüşümü kızılötesi (FTIR) spektrumları. Bir. İşlenmemiş orta akışlı filtre kare kağıdının spektrumları, APS ile işlenmiş orta akışlı filtre kare kağıdınınkine benzerdi. APS ile muamele edilmiş kare kağıt için 902-1.170 ^cm-1 ve 1.21...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Selüloz filtre kağıdı, Grade1 (orta akışlı filtre kağıdı)	GE Sağlık Ticaret A.Ş. Singapur	1001 110
Selüloz filtre kağıdı, Grade113 (Hızlı akışlı filtre kağıdı)	Sigma-Aldrich, Singapur	1113-320
3-Aminopropiltrimetoksisilan	Sigma-Aldrich, Singapur	T1255	>96%
Gluteraldehit	Sigma-Aldrich, Singapur	G6257	Derece II, H2O'da %25
Sığır serum albümü	Sigma-Aldrich, Singapur	A2153
Yağsız süt tozu	Louis François ·		Mutfak Kapari, Singapur tarafından paketlenmiştir
Tris tabanı	Promega	H5135
Sodyum periyoat	Merck	106597
Na2HPO4	Merck	106585
KH2PO4	Merck	104873
NaCl (Doğal)	CALBIOCHEM (CALBIOCHEM	567441
NaOH (NanoOH	Merck	106462
Hcl	Merck	100317
Fosfat tampon salin (PBS)	Yok	Yok	137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.0 mmol/L Na2HPO4 ve 1.5 mmol/L KH2PO4 içeren PBS, su ile hazırlanır ve 0.1 mol/L NaOH veya 0.1 mol/L HCl ile pH 7.4'e ayarlanır
aseton	Tee Hai Chem Ticaret Ticaret A.Ş.	9005-68
TMB ve hidrojen peroksit çözeltisi karışımı	1 Adımlı ultra TMB-ELISA çözümü, Thermo Scientific Pierce	34029	1 L
Afinite saflaştırılmış keçi anti-Fare IgG-Fc kaplama antikoru	Bethyl Laboratuvarları A.Ş	A90-131A
Fare referans serumu	Bethyl Laboratuvarları A.Ş	RS10-101-5	9.5 mg / mL
HRP konjuge keçi anti-fare IgG-Fc algılama antikoru	Bethyl Laboratuvarları A.Ş	A90-131P
ekipman
Fourier dönüşümü kızılötesi spektrofotometresi	Shimadzu Kızılötesi Prestij-21	Yok
fırın	NUVE FN500	Yok
Turbo karıştırıcı VM-2000	MYC LTD. ŞTİ.	Yok
Resim J	RGB, ücretsiz indirme	Yok

Serisi Serisi Serisi Fuar Serisi ) ) Singapur . Serisi . Serisi .