1. C. tropicalis biyofilm oluşumu
- Candida biyofilmlerini daha önce tarif edildiği gibi 96 oyuklu düz tabanlı polistiren mikrotitre plakasında hazırlayın (Şekil 1).
- Çok kanallı bir pipet kullanarak 96 oyuklu bir mikrotitre plakasına 100 μL C. tropicalis kültürü (yukarıdaki gibi hazırlanmış 106 hücre / mL stoktan) ekleyin (Şekil 2A). Mantar hücreleri eklemeyerek son iki sütunu (11 ve 12) 'mantar artı serum' ve 'mantar yok ve serum yok' negatif kontrolleri olarak tutun. 11 ve 12 numaralı sütunları tek başına 100 μL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 morfolinpropansülfonik asit (MOPS) ortamıyla doldurun.
- Mikrotitre plakasını bir kapak ve alüminyum folyo ile örtün. Plakayı sabit koşullar altında 37 ° C'de 24 saat inkübe edin.
- Ertesi gün, çok kanallı bir pipet kullanarak (biyofilmlere dokunmadan veya bozmadan) ortamı dikkatlice aspire edin. Kalan ortamı çıkarmak için plakayı kurutma tabakaları üzerinde ters konumda hafifçe vurun.
- Plakayı çok kanallı bir pipet kullanarak 200 μL 1x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) (kuyucuk başına) ile yıkayın. Biyofilmlerin bozulmasını önlemek için PBS'yi kuyunun yan duvarları boyunca çok nazikçe ekleyin. Çok kanallı bir pipet kullanarak PBS'yi dikkatli bir şekilde aspire edin. PBS yıkamasını 2 kez tekrarlayın (toplam üç yıkama).
- Fazla PBS'yi çıkarmak için, plakayı (kapaksız) oda sıcaklığında 30 dakika boyunca biyolojik bir güvenlik kabini içinde havayla kurutun.
2. Biyofilmin antikorlarla tedavisi
NOT: Biyofilmler artık antikorlar tarafından biyofilm olgunlaşmasının inhibisyonunu değerlendirmek için işlenebilir. Poliklonal antikorların kaynağı olarak murin serumu kullanıldı. Sap2 ile aşılanmış farklı gruplar (Sap2-albicans, Sap2-tropicalis ve Sap2-parapsilosis) ve sahte aşılanmış fareler retro-orbital olarak kanadı alındı ve serum izole edildi. Anti-Sap2 antikorlarının varlığı, Sap2'ye özgü enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) kullanılarak doğrulandı.
- İnhibitör aktivitede kompleman rolünü dışlamak için kullanmadan önce serumun (poliklonal antikor kaynağı) 56 ° C'de 30 dakika süreyle ısı inaktivasyonunu gerçekleştirin. Serum seyreltme yapmadan önce serumu ısıyla etkisiz hale getirin.
not: Ek kontroller olarak sahte aşılanmış farelerden, preimmün farelerden ve Sap2'ye özgü antikor tükenmiş serumdan serum kullanın. Antikor tükenmiş serum, önceki bir çalışmaya göre hazırlandı. Bu protokolde test edilen serum için seri dilüsyonlar (1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1.600, 1:3,200, 1:6.400 ve 1:12.800) arasında biyofilm olgunlaşmasının inhibisyonu 1:25, 1:50 ve 1:100'de gözlenmiştir; bu nedenle, inhibisyon ve serum tüketimi arasında bir denge kurmak için 1:50 seçildi.
- Steril RPMI 1640 MOPS ortamında (1:50) ısıyla inaktive edilmiş serum numunelerinin seri dilüsyonlarını hazırlayın. Biyofilm olgunlaşmasının inhibisyonu için test edilecek tüm serum örnekleri için ortak bir serum seyreltmesi (1:50) kullanın.
- 96 oyuklu mikrotitre plakasının her bir oyuğuna seçilen serum seyreltmesinden 100 μL ekleyin. Her numune için, ekteki düzene göre serum dilüsyonlarını iki kopya halinde ekleyin (Şekil 2B).
- Sütun 10'da serum seyreltmesi eklemeyin; sadece mantar pozitif kontrol için sadece RPMI 1640 MOPS ortamı ekleyin.
not: Sütun 10, G1-G8 ve H1-H8 satırları başlangıçta RPMI-MOPS'ta mantar hücrelerine sahipti. Bununla birlikte, RPMI-MOPS 24 saat sonra bile sütun 10'a eklenirken, G1-G8 satırları PBS kontrolü ve H1-H8 satırları 24 saat sonra serum kontrolü olarak görev yaptı.
- Sütun 11'de, mantar ve serum negatif kontrolü olarak hizmet etmek için tüm kuyucuklara 1:50 oranında bir serum seyreltmesi ekleyin.
- Sütun 12'de, herhangi bir kuyucuğa serum seyreltmesi eklemeyin; bunu mantar yok serum negatif kontrolü olarak tutun.
- Plakayı bir kapak ve alüminyum folyo ile örtün. Plakayı 37 °C'de 24 saat inkübe edin.
3. Biyofilm metabolik aktivite tahmini
- Ertesi gün, serumu çok kanallı bir pipet kullanarak (biyofilmlere dokunmadan veya bozmadan) dikkatlice aspire edin. Kalan serumu çıkarmak için plakayı kurutma tabakaları üzerinde ters konumda hafifçe vurun.
- Plakayı çok kanallı bir pipet kullanarak 200 μL 1x PBS (kuyu başına) ile yıkayın ve biyofilmlerin bozulmasını önlemek için PBS'yi kuyunun yan duvarları boyunca ekleyin. PBS'yi çok kanallı bir pipet kullanarak dikkatlice aspire edin ve PBS yıkamasını 2 kez tekrarlayın (toplam üç yıkama). Fazla PBS'yi kurutmak için plakayı (kapaksız) oda sıcaklığında 30 dakika boyunca biyolojik bir güvenlik kabini içinde havayla kurutun.
- XTT (2,3-Bis- (2-metoksi-4-nitro-5-sülfofenil) -2H-tetrazolium-5-karboksanilid) / menadion'un hazırlanması:
- XTT'yi steril Ringers Laktat'ta 0,5 g/L'lik bir çözelti olarak hazırlayın. 25 mg XTT'yi 50 mL filtreyle sterilize edilmiş Ringers Lactate'de çözün. Alüminyum folyo ile kaplanmış ayrı tüplerde 10 mL alikotlayın ve -80 °C'de saklayın.
- Menadione'yi 10 mM'lik bir stok olarak hazırlayın. 8.6 mg menadionu 5 mL asetonda çözün ve 50 μL'yi 100 ayrı mikrotüpte dağıtın. Alikotları -80 °C'de saklayın.
- 1 μM'lik bir çalışma çözeltisi elde etmek için 10 mL XTT alarak ve 1 μL menadion ekleyerek kullanmadan hemen önce XTT / menadion çözeltisini hazırlayın.
- 96 oyuklu mikrotitre plakasının oyuğu başına 100 μL XTT/menadione çözeltisi ekleyin. Plakayı bir kapak ve alüminyum folyo ile örtün. Plakayı karanlıkta 37 °C'de 2 saat inkübe edin.
- Her bir oyuktan 80 μL renkli süpernatanı 96 oyuklu taze bir plakaya aktarın. Plakayı 490 nm'de okuyun.
- Denklem (1) kullanılarak her bir serum numunesi tarafından biyofilm inhibisyonu yüzdesini hesaplamak için bir referans değer görevi görecek olan sütun 10'daki (yalnızca mantar pozitif kontrol) kuyucukların absorbans değerlerinin ortalamasını hesaplayın.
% Biyofilm inhibisyonu = 100 - 
× 100 (1)
