Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Hazırlıklar
- 10 L fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) hazırlayın: 32.27 g sodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4 12H2O), 4.5 g Sodyum dihidrojen fosfat (NaH2PO4 · 2H2O), 80.0 g sodyum klorür (NaCl) ultra saf suya 10 L'lik bir nihai hacme eklenir. Çözeltiyi oda sıcaklığında (RT) saklayın.
- 200 mL PBS-T hazırlayın: 100 μL polioksietilen (10) oktilfenil eter ile 1.1. adımdan 200 mL PBS, %0.05'lik bir nihai konsantrasyona kadar (hacim: hacim). RT'de saklayın.
- Eldiven ve göz koruması giyerken,% 10 tamponlu nötr formalin çözeltisinde% 15 sakaroz% 10 sakaroz% 10 tamponlu nötr formalin çözeltisine (Malzeme Tablosu) 50 mL'lik bir nihai hacme 7.5 g sükroz eklenir. RT.
adresinde saklayın
Dikkat: % 10 tamponlu nötr formalin çözeltisinde formaldehit ile soluma ve / veya cilt / göz teması tehlikeli olabilir. Dikkatli tutun.
- 1.5 mL 200 birim / mL falloidin-floresan boya konjugat stok çözeltisi hazırlayın: falloidin-floresan boya konjugatı (1 şişede 300 birim, liyofilize katılar, uyarma ve emisyon dalga boyları: sırasıyla 581 nm ve 609 nm) 1.5 mL metanol içinde süspanse edilir. Solüsyonu karanlıkta -20 °C'de saklayın.
- 5 mg / mL 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol, dihidroklorür (DAPI) stok çözeltisi hazırlayın: 2 mL N, N-dimetilformamid (DMF) içinde 10 mg DAPI. Solüsyonu karanlıkta -20 °C'de saklayın.
- PBS'de% 5 sığır serum albümini (BSA) hazırlayın: 0.5 g BSA, 10 mL PBS. 4 °C'de saklayın.
- Bir pense kullanarak 18 gauge düz bir iğnenin eğimli ucunu çıkarın ve sıvının iğne lümeninden akmasına izin vermek için kıstırılan ucu bir kıskaçla uzunlamasına doğru sıkıştırın (Şekil 1A1).
not: Protokol buradan duraklatılabilir.
2. Jejunum'un Hayvan Diseksiyonu ve İzolasyonu
- Bir farenin perfüzyon fiksasyonu
- Eldiven giyin ve iyi havalandırılan bir alanda çalışın.
- 100 mL'lik bir cam beher,% 10 tamponlu nötral formalin solüsyonu, cerrahi aletler (makas, forseps), metalik bir tepsi, 6-0 naylon kesim sütürler, 1.7'deki gibi hazırlanmış 18 gauge düz iğne, 22 gauge kanatlı iğne, 20 mL şırınga hazırlayın.
- Cam beherden 20 mL %10 tamponlu nötr formalin solüsyonunu 20 mL şırıngaya yükleyin ve 22 gauge kanatlı iğneyi prize takın.
- 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde 20 mL PBS'ye (son% 5 jelatin) 1 g jelatin tozu ekleyerek sıvı jelatin hazırlayın. RT'de 15 dakika beklettikten sonra, 50 °C'de bir su banyosunda 15 dakika çalkalamadan inkübe edin.
- Jelatini tamamen çözmek için kısaca girdap yapın ve 50 °C'de 15 dakika daha inkübe edin. Kullanana kadar tüpü RT'de bırakın.
- Servikal çıkık ile yetişkin bir fareye ötenazi yapın.
- Adım 2.1.6'daki fareyi metal bir tepsiye yerleştirin ve cerrahi aletler kullanarak ensiform kıkırdak yoluyla cilt üzerinde küçük bir kesi yapın.
- Göğüs ve karın bölgelerini ortaya çıkarmak için kesiği iki elinizle genişletin.
- Diyaframı ortaya çıkarmak için peritonu açın ve ardından diyaframı her iki taraftan açın.
- Göğüs kafesini her iki taraftaki ön aksiller çizgiler boyunca kesin, ardından kalbi açığa çıkarmak için timüs pozisyonunda enine yönde keserek göğüs duvarını çıkarın.
- Kanı boşaltmak için sağ kulakçık kulak kepçesinde küçük bir kesi yapın ve sol karıncığın tepesine 22 gauge kanatlı bir iğne sokun. Dokuları% 10 tamponlu nötr formalin çözeltisi ile perfüze etmek için pistonu itin.
- Pelvisteki organları açığa çıkardıktan sonra, rektumun ucunu anüsten kesin ve mezenteri keserek bağırsakları vücuttan ayırın.
- Jejunumu izole etmek için, bağırsakları mide antrumunun anal tarafından 4 cm uzakta kesin. Kalan ince bağırsağın anal yarısını atın.
- Yıkama prosedürünü kolaylaştırmak için jejunumu ikiye bölün. 20 mL şırıngaya 20 mL %10 tamponlu nötr formalin çözeltisi yükleyin ve adım 1.7'de hazırlanan 18 gauge düz iğneyi prize takın.
- Bağırsak içeriğini temizlemek ve bağırsak lümen yüzeyini sabitlemek için kırpılmış jejunumun bir ucundan% 10 tamponlu nötr formalin çözeltisi enjekte edin (Şekil 1A2).
- Adım 2.1.15'te açıklandığı gibi PBS enjekte ederek bağırsak lümenini yıkayın.
- PBS'yi sıvı jelatin ile değiştirmek için sıvı jelatini adım 2.1.15'te açıklandığı gibi bağırsak lümenine yıkayın.
- Kırpılan jejunumun bir ucunu 6-0 naylon kesim sütür kullanarak sütür ligasyonu ile kapatın, jejunumu sıvı jelatin ile doldurun ve diğer ucunu sütür ligasyonu ile kapatın (Şekil 1A3).
- Bir kriyokalıbın basık kısmına sosis şeklindeki bir jejunum bölümüne sığdırmak için dört dikiş düğümü ekleyin (Şekil 1A4).
not: 20 mm x 25 mm x 5 mm basık kesite sahip kriyokalıplar için ~20 mm sosis benzeri bir jejunum bölümü tercih edilir.
- Dokuları 50 mL %15 sükroz içinde %10 tamponlu nötr formalin çözeltisi içinde gece boyunca 4 ° C'de bekletin.
not: Bu adımlar, sükroz ile kriyoproteksiyon ve jelatin ve dokunun formalini ile protein fiksasyonu sağlar. Formalin-jelatinleştirilmiş jelatin RT'de erimezken, 4 °C'de sabitlenmemiş jelatinleştirilmiş jelatin RT'de erir.
3. Jelatin Dolgulu Jejunum Dokularının Çıtçıtla Dondurulması
- Jejunumun dikiş düğümlerinden kesilmesiyle, her iki ucu bağlı üç sosis benzeri jejunum parçası elde edilir (Şekil 1A4). Dondurulmuş doku örneklerinin hazırlanması için gömme bileşiğinin eklenmesi için sosis benzeri parçaları bir kriyo kalıpta hizalayın.
- Kriyomoldu sıvı nitrojen ile soğutulmuş izopentan içinde dondurun. Kriyo kalıpları -80 °C'de saklayın
NOT: Protokol buradan duraklatılabilir.
4. Serbest Yüzen Kriyoseksiyonlar Kullanılarak Tutam Hücrelerinin İmmünofloresansı
- Kriyoseksiyon
- Hem kriyostat odası sıcaklığını (CT) hem de nesne sıcaklığını (OT) -22 °C'ye ayarlayın. Donmuş doku bloğunu en az 15 dakika boyunca kriyostat odasındaki bir kriyokalıba yerleştirin.
- 35 mm'lik bir kültür kabına 3 mL PBS ekleyin.
- Donmuş doku bloğunu kriyomoldtan çıkarın ve jejunumun enine kesitini ortaya çıkarmak için bloğu bir tıraş bıçağıyla ikiye bölün. Kesme düzlemini tıraş bıçağıyla bölmek için bloğun yarısını bir aynaya (bir kriyostat adaptörü) monte edin.
- Jelatin dolgulu jejunumu 30 μm kalınlığında bölümlere ayırın. Bölümleri adım 4.1.2'de hazırlanan 35 mm'lik kültür kabına nazikçe aktarmak için donmuş forseps kullanın (Şekil 2B, sağda).
- Primer antikorların uygulanması
- 35 mm'lik kültür kabındaki serbest yüzen bölümleri, her biri 3 mL PBS-T ile 5 dakika boyunca 3 kez, karşılıklı bir çalkalayıcı üzerinde hafif çalkalayarak (yaklaşık 36 kez/dak) yıkayın.
- Antijen alma solüsyonu hazırlayın: 2.7 mL ultra saf su içinde 0.3 mL antijen alma solüsyonu konsantresi (Malzeme Tablosu). Serbest yüzen bölümler içeren 35 mm'lik kültür kabına 3 mL antijen alma çözeltisi ekleyin.
- Kapağı kapatın, çanak ile kapak arasındaki boşluğu bir vinil bant şeridi ile kapatın ve 50 ° C'de bir hibridizasyon inkübatöründe 3 saat boyunca sallamadan inkübe edin.
- Çanağı inkübatörden çıkarın ve RT'de 20 dakika soğutun. Vinil bandı çıkardıktan sonra, bölümleri 3 mL PBS-T ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın ve hafif çalkalayın.
- PBS-T'yi aspire edin ve bölümlere 5 damla bloke edici solüsyon (Malzeme Tablosu) ekleyin. Hafif çalkalama ile RT'de 5 dakika inkübe edin.
- Birincil antikor çözeltisini hazırlayın: 5 μL fosfo-Y1798 girdin (pY1798) antikorları ile PBS'de 495 μL% 5 BSA (Malzeme Tablosu). Bölümlere 500 μL primer antikor çözeltisi ekleyin (bloke edici çözeltinin çıkarılmasına gerek yoktur).
- Çanağı nemlendirilmiş bir inkübasyon odasına koyun ve hafif çalkalama ile gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
not: Gece boyunca kuluçka süresi üç geceye kadar uzatılabilir.
- İkincil antikorların uygulanması
- Bölümleri 3 mL PBS-T'de her biri 5 dakika boyunca 3 kez hafif çalkalanarak yıkayın.
- Seyreltilmiş DAPI stok çözeltisi hazırlayın: 2 μL DAPI stok çözeltisi (Adım 1.5), 998 μL PBS.
- İkincil antikor çözeltisi yapın: PBS'de 476 μL% 5 BSA, 10.5 μL seyreltilmiş DAPI çözeltisi, 12.5 μL falloidin-floresan boya konjugat stok çözeltisi, 1 μL keçi anti-tavşan IgG-floresan boya konjugatı (dalga boyu: uyarma 496 nm, emisyon 520 nm).
- PBS-T'yi aspire ettikten sonra, ikincil antikor çözeltisini uygulayın ve hafif çalkalama ile RT'de 30 dakika boyunca ışık korumalı bir inkübasyon odasında inkübe edin.
- Bölümleri 3 mL PBS-T ve hafif çalkalama ile her biri 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
- Son yıkamadan sonra, PBS-T'yi çıkarın ve polioksietilen (10) oktilfenil eter içermeyen 3 mL PBS ile değiştirin. Çanağı stereoskopik bir mikroskoba aktarın.
- 200 μL PBS'yi MAS kaplı beyaz cam slaytın ortasındaki bir damlacığa yerleştirin ve bir P200 pipet ucu kullanarak tabaktan bir jejunum bölümünü damlacığa aktarın.
- Stereoskopik mikroskop altında kesit hizalamasını ayarladıktan sonra, kesiti çevreleyen kalan tüm PBS'yi aspire edin.
- 20 μL sulu montaj ortamı ekleyin ve ortamın üzerine 20 x 20 mm'lik bir lamel yerleştirin.
- Lamel kenarlarını hemen ksilen bazlı montaj ortamıyla kapatın. Sürgüyü ahşap bir mappe üzerine yerleştirin ve ksilen bazlı montaj ortamının RT'de 2 - 3 saat katılaşmasına izin verin.
not: Protokol buradan duraklatılabilir. Ksilen bazlı montaj ortamı katılaştıktan sonra, slaytlar RT'de ışık korumalı bir kayar kutuda 2-3 hafta saklanabilir.
5. Konfokal mikroskopi
- Konfokal mikroskobun 63X hedefine daldırma yağı koyun. Lameli slaytı aşağı çevirin ve slaytı sahne alanına yerleştirin.
- 405, 488 ve 555 nm lazer dalga boylarında elde edilen TC görüntülerini sayısallaştırın ve görüntüleri tiff formatında (.tiff) kaydedin.
not: Floresan boyalar için uygun bir algılama filtresi seti seçin (yani, uyarma/emisyon maksimumları: 358/461 nm, 490/525 ve 590/617).
