Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. 293T hücrelerinin lusiferaz ile transfeksiyonu ve viral süpernatan hasadı
- 293T hücre kültürü
- Her biri bir litre Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamına (DMEM) aşağıdakileri ekleyerek ortamı hazırlayın: 110 mL ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS), 11 mL penisilin-streptomisin.
- 5 x 106 293T hücrelerini çözün ve bunları yukarıda açıklandığı gibi hazırlanmış ortamla birlikte bir T175 şişesine aktarın.
- 293T hücrelerini 6 gün boyunca her 3 günde bir 1:10'a bölün. Hücrelerin% 90'dan fazla birleşmesine izin vermeyin.
- 293T hücrelerinin transfeksiyonu
not: 293T hücreli bir T175 şişesinin transfekte edilmesi için aşağıdaki reaktif miktarları hesaplanır. Daha fazla şişe dönüştürülecekse buna göre ayarlayın.
- Bir pipet kullanarak 50 mL'lik iki tüpün her birine 1,5 mL ortam aktarın. Bir tüpe 10 μg VSV-G plazmid, 20 μg Gag/pol ve 20 μg tıklama böceği kırmızı TD domates (CBR-TDR) lusiferaz plazmidi ekleyin ve karıştırın. Diğer tüpe 100 μL DNA in vitro transfeksiyon reaktifi ekleyin ve karıştırın. Her iki tüpü de oda sıcaklığında (RT) 5 dakika
inkübe edin
not: Bu el yazmasında anlatılan tüm plazmitler Dr. Vladimir Ponomarev tarafından sağlanmıştır.
- DNA in vitro transfeksiyon reaktifini içeren ortamı, DNA plazmitlerini içeren tüpe (yaklaşık 30 saniyeden fazla) damla damla aktarın ve bir pipetle hafifçe karıştırın. RT'de 20 dakika inkübe edin.
- Bu 20 dakikalık inkübasyon sırasında, 5-10 mL% 0.05 tripsin ekleyerek 293T hücrelerini ayırın. Hücreler ayrıldıktan sonra, 10 mL ortam ekleyin ve 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin. Hücreleri 1.5 mL ortamda yeniden süspanse edin.
- DNA in vitro transfeksiyon reaktifini ve DNA plazmitlerini içeren ortamı 293T hücrelerine ekleyin ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
- Bir T175 şişesine aktarın ve 18 mL ortam ekleyin. Gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
- Ertesi gün, hücreleri ayırmadan ortamı bir cam pipetle dikkatlice aspire edin. 18 mL taze ortam ile değiştirin. Bir inkübatörde gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
- Viral süpernatan hasadı
- Buz üzerine konan bir pipet kullanarak viral süpernatanı çıkarın. Hücreleri ve döküntüleri peletlemek için 800 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
not: Hücre peleti büyükse, süpernatan çıkarıldığında hücreler muhtemelen şişeden bozulmuştur. Bu hücreler, taze ortam içeren yeni bir şişede tekrar kaplanabilir.
- Viral süpernatanı 0.22 μm'lik bir filtre kullanarak filtreleyin.
- Viral süpernatanı hemen kullanın. Buz üzerinde veya 4 °C'de 24 saate kadar tutun veya uzun süreli saklama için -80 ° C'de dondurun.
2. Aktive edilmiş insan T hücrelerinin lusiferaz ile genişlemesi ve transdüksiyonu
- İnsan T hücrelerinin in vitro aktivasyonu
- Steril 15 mL'lik bir tüpe% 0.1 sığır serum albümini (BSA) ve 2 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içeren 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyerek, boncuklar ekleyerek (iki T hücresi başına bir boncuk), 2 dakika boyunca bir mıknatıs rafına yerleştirerek ve PBS'yi emerek boncukları yıkayın.
- Ortamı adım 1.1.1'de açıklandığı gibi hazırlayın, ardından 30 IU / mL'lik son konsantrasyona IL-2 ekleyin ve yıkanmış boncukları ekleyin. Aktive edilecek her iki milyon T hücresi için 2,5 mL ortam yapın.
- Bir hemositometre ve tripan mavisi boyası kullanarak T hücrelerini (taze saflaştırılmış veya önceden saflaştırılmış, dondurulmuş, çözülmüş ve yıkanmış) sayın. Adım 2.1.2'de hazırlanan ortama T hücreleri ekleyin ve karıştırmak için tüpü yavaşça ters çevirin. T hücreleri, hücrelerin kaynağına ve genel sağlığına bağlı olarak en az 20 kat genişleyecektir. Fareleri tedavi etmek için gereken sayıyı hesaplayarak ve 20'ye bölerek aktive edilecek T hücrelerinin sayısını belirleyin. Burada, ön deneylere dayalı olarak fare başına 20 x 106 T hücre kullanıldı.
- 24 oyuklu bir doku kültürü plakasının her bir oyuğunda iki milyon T hücresi, boncuk ve (interlökin 2) IL-2 içeren 2.5 mL ortam plakası. Nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de kültür.
- T hücrelerini önümüzdeki 3 gün boyunca her gün 20x mikroskop altında inceleyin ve lusiferaz ile ne zaman transdüksiyon yapılacağını belirleyin. Hücreler bir araya toplandıklarında ve ortamı tükettiklerinde hazırdır ve onu kırmızı / pembeden açık turuncuya dönüştürür.
- Retronektin plakalarının hazırlanması
not: Retronektin, gen iletimini arttırdığı için transdüksiyonda kullanılan plakaları kaplamak için kullanılır.
- PBS'de 2 mL 20 μg / mL retronektin, işlenmemiş 6 oyuklu bir plakanın kuyucuğuna ekleyin. RT'de 2 saat veya 37 °C'de 1 saat inkübe edin. Transdüksiyon yapılacak her iki milyon T hücresi için bir retronektin kaplı kuyucuk gereklidir.
- Plakanın altını çizmeden retronektini aspire edin.
- 6 oyuklu plakadaki kuyucuk başına PBS'de (steril filtrelenmiş) 3 mL% 2 BSA ekleyin. RT'de 30 dakika inkübe edin.
- Omurga
- Plakanın altını çizmeden BSA'yı aspire edin.
- Kuyucukları kuyu başına 3 mL PBS ile bir kez yıkayın. Devam edin veya taze PBS ile değiştirin ve plakayı gece boyunca 4 °C'de kapalı bırakın.
- Kuyucuk başına 2 mL CBR-TDR lusiferaz viral süpernatant (adım 1.3'te toplanmıştır) ekleyin.
- 32 ° C'de 90 dakika boyunca 1.240 x g'da santrifüjleyin.
- Iletim
- T hücrelerini sayın.
- Plakanın altını çizmeden viral süpernatanı aspire edin.
- 30 IU / mL insan IL-2 içeren 6 mL DMEM'de kuyu başına iki milyon T hücresi plakası.
- T hücrelerini günlük olarak inceleyin. T hücreleri, genellikle 2 gün sonra, neredeyse birleştiklerinde genişlemeye hazırdır.
- Hücreler neredeyse birleştiğinde, bir pipet kullanarak plakanın altından nazikçe yıkayın ve her bir kuyucuğu ayrı bir T75 şişesine aktarın. Şişe başına toplam 15 mL ortam için 9 mL ortam ekleyin.
- Ertesi gün, 15 mL daha medya ekleyin. Hücreler, bu ortam ilavesinden bir gün sonra farelere enjekte edilmeye hazır olmalıdır. Akış sitometrisi yaparak başarılı transdüksiyonu onaylayın (lusiferaz yapısı, PE kanalında görülebilen bir TD domates floroforu içerir).
3. İmmün sistemi baskılanmış farelerde lusiferaz ile transdüksiyonlu T hücrelerinin aşılanması
- T hücrelerini enjeksiyon için hazırlayın ve sayın.
- T hücrelerini şişelerden çıkarın ve sayın. Hücreler, genellikle aktivasyondan sonraki 7. güne kadar 20x-30x genişlediklerinde enjekte etmeye hazırdır.
- T hücrelerini 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin. 2 mL ortamda yeniden süspanse edin ve bir mıknatıs rafı kullanarak boncukları çıkarın.
- T hücrelerinin bispesifik antikorlardan ayrı olarak enjekte edileceği deneyler için, T hücrelerini sayın ve nihai konsantrasyon 100 μL ortam başına 20 milyon T hücresi olacak şekilde yeniden süspanse edin. Adım 3.2'ye atlayın. Ex vivo silahlı T hücreleri (EAT'ler) kullanan deneyler için adım 3.1.4'e atlayın.
- Ex vivo silahlı T hücreleri kullanan deneyler için, T hücrelerini sayın ve bunları fare başına 20 milyon hücre olacak şekilde her grup için ayrı ayrı 1,5 mL tüplere ayırın. Örneğin, her biri beş fareden oluşan üç grup varsa, her biri 100 milyon T hücresi içeren üç adet 1.5 mL tüp hazırlayın.
- 1.5 mL'lik tüpleri 800 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. T hücresi peletini bozmadan ortamı dikkatlice çıkarın. Bispesifik antikorları içeren 50 μL'den fazla olmayan ortamda yeniden süspansiyon haline getirin. RT'de 30 dk.
inkübe edin
not: Bu çalışmada yapılan deneyler için, laboratuvarda üretilen tescilli IgG-[L]-scFv T hücresi ile etkileşime giren bispesifik antikorlar kullanılmıştır. T hücresi kurması için, 20 x 106 T hücre başına 5 μg antikor kullanın. Ticari olarak temin edilebilen bispesifik antikorlar da kullanılabilir.
- Her tüpe 1.450 μL ortam ekleyerek fazla antikorları yıkayın. 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin, ortamı dikkatlice aspire edin ve 100 μL ortam başına 20 milyon silahlı T hücresi konsantrasyonunda yeniden süspanse edin.
- Farelere enjeksiyon ve aşılama
- Fareleri, 1 L / dak oksijende% 3.5 (h / h) inhale izofluran sağlayan bir odada uyuşturun. Arka bacak pedalı çekme refleksi ortadan kalktığında fareler tamamen uyuşturulur.
NOT: Prosedür boyunca termal destek sağlayın.
- 26 G'lik bir iğne kullanarak, fare başına retroorbital olarak 100 μL besiyerine 20 milyon T hücresi enjekte edin.
- İn vivo T hücresi sağkalımını desteklemek için 1.000 U rekombinant IL-2'yi deri altından uygulayın.
- Bispesifik antikorları retroorbital olarak (T hücresi enjeksiyonu için kullanılmayan göz içine) veya intraperitoneal olarak uygulayın. Farelerin anesteziden kurtulmalarına ve kafeslerine dönmelerine izin verin.
NOT: Yine burada, laboratuvarda üretilen tescilli antikorlar kullanılmıştır, ancak bunun yerine ticari olarak temin edilebilen antikorlar kullanılabilir. Buradaki deneylerde, doz başına fare başına 0.3-10 μg antikor uygulandı. Antikorlar 3-4 hafta boyunca haftada iki kez uygulandı.
4. Lusiferaz ile transdüksiyonlu T hücreleri ile aşılanmış farelerin in vivo görüntülenmesi
>NOT: Bu adım, T hücrelerinin ve/veya antikorların farelere uygulandığı gün olması gerekmeyen görüntüleme gününde gerçekleştirilmelidir. Tipik olarak, lusiferaz ile transdüksiyona uğramış T hücrelerinin uygulanmasından 24 saat sonra görüntüleme yaparız.
- D-lusiferinin hazırlanması
- 1 g D-lusiferini 33.3 mL steril PBS içinde çözün (son konsantrasyon: 30 mg / mL).
- Çözünmüş D-lusiferini 33 x 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine alın ve tüpleri -20 °C'de tutun.
- Görüntüleme gününde, görüntülenecek hayvan sayısı için yeterli miktarda 30 mg / mL D-lusiferin alikotunu çözün. 10 hayvan için bir tüp yeterlidir.
NOT: Kullandıktan sonra kalan D-lusiferini tekrar dondurun. D-lusiferin, en az beş donma/çözülme döngüsü için stabildir.
- D-lusiferinin farelere uygulanması
not: Farelere D-lusiferin uygulamadan önce, görüntüleme yazılımını açın ve sistemi başlatın. Kameranın soğuması birkaç dakika sürebilir ve bu, substratın uygulanmasından 5 dakika sonra görüntülemenin yapılabilmesini sağlamak için farelere D-lusiferin enjekte edilmeden önce yapılmalıdır.
- 1 L / dak oksijende% 3.5 (h / h) inhale izofluran sağlayan bir odada beş fareye kadar anestezi yapın. Arka bacak pedalı geri çekilme refleksi ortadan kalktığında fareler tamamen uyuşturulur.
- Fareler tamamen anestezi uygulandıktan sonra, 26 G'lik bir iğne ile retroorbital enjeksiyon ile fare başına 100 μL 30 mg / mL D-lusiferin (fare başına 3 mg) uygulayın. D-lusiferin'i bir sonraki gruba uygulamadan önce bu fare grubunu hayal edin. Bir sonraki fare grubunu, önceki grup görüntülenirken anestezi altına alınmak üzere izofluran odasına yerleştirin.
- Lusiferaz ile transdüksiyonlu T hücrelerinin görüntülenmesi
- Anestezi uygulanmış fareleri görüntüleyicinin ışık geçirmez odasına taşıyın ve 0,5 L / dk'da% 3 izofluran uygulamaya devam edin. Fareleri, ksenogrefti taşıyan yan kısım kameraya bakacak şekilde yanlarına yerleştirin. Akciğerlerdeki T hücresi varlığını değerlendirmek için fareler sırtüstü pozisyonda iken başka bir görüntü seti alın.
- Çekim Kontrol Panelini kullanarak Lüminesan, Fotoğraf ve Kaplama'yı seçin. Pozlama süresini otomatik, gruplamayı orta ve F/Durdur'u 1 olarak ayarlayın. Görüntüleri elde edin. İlk görüntüden sonra, pozlama süresini ilk görüntü için otomatik olarak hesaplanan süreyle eşleşecek şekilde ayarlayın, böylece sonraki görüntüler doğrudan karşılaştırılabilir. Piksel doygunluğu olmadan en parlak sinyali elde etmek için en uygun pozlama süresini belirlemek üzere birden fazla pozlama süresine sahip görüntüler yakalamak yararlı olabilir.
- Fareleri izoflurandan çıkarın, kafeslerine dönün ve uyanık ve yürüyene kadar gözlemleyin.
- Tüm gruplar görüntülenene kadar adım 4.2.1'den itibaren adımları tekrarlayın.
