$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Hücre ve parazit kültürleri
- Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonundan (CCL-7) LLC-MK2 (Rhesus Maymun Böbrek Epiteli) hücrelerini, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ortamında bulunan 25cm2'lik bir hücre kültürü şişesinde büyütün, %10 ısıyla inaktive edilmiş FBS (Fetal Sığır Serumu) ve antibiyotikler (100 U/mL Penisilin ve 100 μg/mL Streptomisin) ile desteklenmiştir 37 °C'de% 5 karbondioksit (CO2).
- LLC-MK2 hücrelerini önceki bir protokole göre Trypanosoma cruzi (Y suşu) ile enfekte edin.
- LLC-MK2 ile enfekte olmuş hücrelerin (5 mL) süpernatantını 15 mL'lik bir hücre kültürü konik santrifüj tüpünde toplayın ve hücre kalıntılarını azaltmak için 10 dakika ve 22 ° C'de 500 x g'de santrifüjleyin. Tripomastigotların süpernatana yüzmesine izin vermek için tüpü 37 ° C'de 10 dakika tutun.
- Süpernatanı yeni bir konik tüpte toplayın ve 22 ° C'de 15 dakika boyunca 2500 x g'da santrifüjleyin. Bir Neubauer odasındaki hücreleri sayarak hücre yoğunluğunu belirlemek için süpernatanı atın ve parazitleri içeren peleti tam bir RPMI ortamında yeniden süspanse edin.
2. İmmünofloresan protokolünü kontrol edin
NOT: Sabitlendikten sonra, lamel içeren plakaları 4 °C'de 1x fosfat tamponlu salin (PBS) (pH 7.2) içinde bir hafta boyunca saklamak mümkündür. Saklanabilmesi için hücrelerin geçirgenlik aşamasından geçmemiş olması önemlidir.
- LLC-MK2 hücrelerini (2 x 10,4), ultraviyole (UV) sterilize edilmiş yuvarlak lameller içeren 24 oyuklu plakalara 16 saat boyunca RPMI ortamında yerleştirin.
- Enfekte hücreler için, her bir oyuğa orantılı olarak (enfeksiyonun çokluğu, MOI 10: 1) T. cruzi (madde 1.4) içeren bir süpernatant ekleyin ve 6 saat enfeksiyon için bırakın. Enfekte olmuş ve enfekte olmamış hücreleri içeren lamelleri PBS solüsyonu ile beş kez yıkayın ve oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca 1x PBS'de (pH 7.2) %2 paraformaldehit ile sabitleyin.
- Lamelleri her biri 1x PBS (pH 7.2) ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- Lamelleri RT'de 10 dakika boyunca 1x PBS'de (PH 7.2) %0.2 IGEPAL CA-630 (oktilfenoksipolietoksietanol) ile geçirgenleştirin.
- Lamelleri her biri 1x PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- Lamelleri RT'de 30 dakika boyunca bloke edici solüsyonla (% 2 sığır serum albümini, 1x PBS'de BSA, pH 7.2) inkübe edin.
- Lamelleri RT'de 30 dakika boyunca ya fare monoklonal anti-hnRNPA1 (anti-heterojen ribonükleoprotein-A1) (seyreltme 1:200) ya da fare poliklonal anti-TcFAZ (anti-Trypanosoma cruzi flagellum bağlanma bölgesi proteini) (seyreltme 1:100) ile inkübe edin.
- Lamelleri her biri 1x PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- Lamelleri RT'de 30 dakika boyunca Alexa Fluor 488'e (1:600) konjuge edilmiş keçi anti-fare IgG F (ab')2 (H+L) ile Alexa 594'e (1:300) konjuge falloidin ile birlikte aktin filamentlerini (F-aktin) bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş konakçı hücrede lekelemek için inkübe edin.
- Her biri 5 dakika boyunca 1x PBS (pH 7.2) ile üç kez yıkayın.
- Slaytın yüzeyine 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ortamı ile az miktarda ProLong Gold antifade montaj reaktifi uygulayın.
- Forseps kullanarak, kabarcıkların oluşmasını önlemek için lameli montaj ortamındaki lameli hafifçe eğin. Kuruduktan sonra, istenirse lamel kapatın.
>3. Aynı konakta yükseltilmiş monoklonal ve poliklonal antikorları kullanarak çift etiketlemeli immünofloresan protokolü
- Yukarıda açıklanan 2.1 ila 2.6 arasındaki adımları tekrarlayın.
- Enfekte olmuş ve enfekte olmamış hücreleri içeren lamelleri, RT'de 30 dakika boyunca bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş ev içi fare poliklonal anti-TcFAZ antikoru (1:100) ile inkübe edin.
- Lamelleri her biri 1x PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- Lamelleri, bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş Alexa Fluor 647 (1:600) ile konjuge edilmiş keçi anti-fare IgG F (ab ') 2 (H + L) ile RT'de 30 dakika inkübe edin.
- Lamelleri her biri 1x PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- RT'de 30 dakika boyunca bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş (0.12 mg / mL) AffiniPure tavşan anti-fare IgG (H + L) ile ikinci bloke adımını gerçekleştirin.
- Lamelleri her biri 5 dakika boyunca 1x PBS (pH 7.2) ile üç kez yıkayın. Daha sonra fare monoklonal anti-hnRNP A1 IgG2b antikoru (1:200) ile RT'de 30 dakika inkübe edin.
- Lamelleri her biri 1x PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- Lamelleri, Alexa Fluor 488'e (1:600) konjuge edilmiş keçi anti-fare IgG2b antikoru ve blokaj solüsyonunda seyreltilmiş Alexa 594'e (1:300) konjuge phalloidin ile 30 dakika inkübe edin.
- Lamelleri her biri 1x PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- Yukarıda açıklanan 2.8 ila 2.10 arasındaki adımları tekrarlayın.