$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Otomatik Hızlı Protein Sıvı Kromatografisi (FPLC) Sistemi Kullanılarak Afinite Kromatografisi ile Antikor Saflaştırması
>NOT: Aşağıdaki prosedür genellikle çoğu otomatik sisteme uygulanabilir. Saflaştırma oda sıcaklığında veya 4 °C'de yapılabilir (FPLC sistemi serin bir odada tutuluyorsa). Şartlandırılmış ortamdan saflaştırılmış antikorun maksimum geri kazanımını sağlamak için uygun kolon matrisi, bağlama tamponu, elüsyon tamponu ve pH dahil olmak üzere optimum saflaştırma koşullarını belirlemek için bir dizi keşif testi yapılabilir (Sonuçlar bölümüne bakın). Optimal koşullar, saflaştırılan antikor veya proteine bağlıdır. Saflaştırmalar otomatik bir FPLC sisteminde gerçekleştirildi. Saflaştırmalar, 5 ml Protein A sütunu kullanılarak oda sıcaklığında gerçekleştirildi.
- Aşağıdaki tamponları ultra saf su kullanarak hazırlayın ve önerilen pH'a ayarlayın, ardından 0,22 μm'lik bir filtreden süzün.
- Aşağıdakileri karıştırarak 1 L fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) pH 7.4 (bağlayıcı tampon) hazırlayın: 0.14 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0.01 M Na2HPO4 ve 0.001 M KH2PO4. Tamponu filtrelemeden önce gerekirse pH'ı ayarlayın.
- 500 ml 0.1 M glisin-HCl pH 2.7 (elüsyon tamponu) hazırlayın. Tamponu filtrelemeden önce pH'ı ayarlayın.
- 50 ml 1 M Tris pH 9.0 (nötralizasyon tamponu) hazırlayın.
- Tüm sistem gücünün ve bilgisayarla iletişim bağlantılarının yapıldığından emin olun. Cihazlar, yazılım 'Sistem Kontrolü' modülünde görünür olmalıdır. UV hücresinin 280 nm dalga boyuna ayarlandığından emin olun. İsteğe bağlı: Bağlıysa ve kullanılacaksa pH metreyi kalibre edin.
- Sistemi yıkamak için A, B ve numune pompasının giriş borularını ultra saf suya daldırın. Boruda hava varsa veya sistemde hava şüphesi varsa pompaları bir şırınga ile boşaltın. Sistemi, sistem denetleyicisi aracılığıyla manuel olarak veya otomatik bir yöntemle suyla yıkayın. Basınç, iletkenlik, UV280 izleme ve pH'ın tutarlı kaldığını ve üreticinin spesifikasyonuna göre kolon için basınç sınırının aşılmadığını gözlemleyin.
not: Anormallikler, devam etmeden önce ele alınması gereken sistemdeki hava veya tıkanıklığı gösterebilir.
- Sistem kontrol modülünde, kolonu bağlamaya başlamak için akış hızını pompa A aracılığıyla yük (numune döngüsünü atlayarak) veya enjeksiyon (numune döngüsünden geçerek) konumunda manuel olarak 1 ml/dk'da başlatın. Kolon konum girişindeki sistem borusunu ayırın ve kolon girişine bağlı durdurucuyu çıkarın.
- Suyun sistem borusundan kolonun üstüne damla damla akmasına izin verin, ardından sistem borusunu kolona takın. Kolon giriş ve giriş bağlantısının su damlaları ile taşması, hava kabarcıklarından arındırılmış bir bağlantı sağlar.
- Kolon çıkışını aşağı akış çıkışına takın ve tüm bağlantı parçalarının sıkıca sabitlendiğinden emin olun. Kolon artık sisteme bağlıyken, kolon özelliklerinde belirtildiği gibi maksimum basınç limiti ve akış hızı limitlerini aşmayın.
- Sütunu 5 sütun hacmi (CV) su ile yıkayın. Gerekirse, UV280 izleme stabilize olana kadar kolon yıkamaya devam edin.
- Sistemi doğru tamponlarda dengelemek için A'nın giriş tüplerini Bağlama tamponuna, B'nin Elüsyon tamponuna ve numune pompasını Bağlama tamponuna daldırın. Manuel işlemle PumpWash kullanarak giriş tüplerini tamponla doldurun.
- Yazılımın 'Metot Düzenleyici' modülünde, kullanılması amaçlanan kolon için bir afinite kromatografisi yöntemi ayarlamak için metot sihirbazını kullanın.
not: Otomatik FPLC sistemleri, önerilen ayarlarla (yani akış hızı ve basınç sınırı) önceden doldurulmuş yöntemlerle ve saflaştırma için seçilen sütuna (üretici, matris ve boyut) dayalı çalıştırma adımlarıyla birlikte gelir.
- Protein A afinite kromatografisi için aşağıdaki çalıştırma adımlarını kullanın:
- Sistemi 5 CV Bağlayıcı tampon ile dengeleyin ve akışı atık kabına toplayın.
- Numuneyi sütuna yükleyin (yüklenecek hacim yöntemde manuel olarak belirtilmiştir) ve akışı ayrı bir kapta toplayın.
- Sistemi 5 CV Bağlayıcı tampon ile yıkayın ve akışı ayrı bir kapta toplayın.
- Elution tamponu kullanarak 5 CV izokratik fraksiyonlama ile elute sütunu ve fraksiyon toplayıcı ile saflaştırılmış antikor örneğini fraksiyonlar halinde toplayın.
- Sistemi 5 CV Bağlayıcı tampon ile dengeleyin ve akışı atık kabına toplayın.
- Yöntem ayarlandıktan sonra, sütuna uygulanacak koşullu ortamın hacmini belirtin ve yöntemi kaydedin.
not: Numune çalışması sırasında hava girmesini önlemek için yöntemde belirtilen hacim gerçek hacimden 5-10 ml daha az olmalıdır. Bu protokolde kullanılan belirtilen hacim 90-120 ml'dir.
- Numune pompası hortumunu, şartlandırılmış ortamı içeren kaba daldırın.
- Belirtilen çıkış borusu üzerinden numune akışını toplamak için ayrı bir kap hazırlayın.
not: Çalışma sırasında bir hata meydana gelmesi veya kolonun bağlama kapasitesinin aşılması durumunda, akışın kolona yeniden uygulanmasını veya saflaştırmanın tekrarlanmasını gerektiren akışın toplanması önemlidir.
- Fraksiyon toplayıcıda toplama tüplerini hazırlayın. 1 ml fraksiyon hacmi başına 100 μl nötralizasyon tamponu ekleyin. FPLC sistemi, fraksiyonları otomatik olarak toplama tüplerine elüte edecektir.
- Yazılımın 'Sistem Kontrolü' modülünde, çalıştırılacak yöntemi açın.
not: Yöntem çalıştırması, yöntemin değişkenlerini kontrol etmeyi, kesir toplayıcı kurulumunu ve sonuç dosyası adını ve depolama konumunu tanımlamayı içeren bir dizi sayfada başlatılır.
- Çalıştırmayı başlatmak için BAŞLAT'a tıklayın. Çalışma, 'Sistem Kontrolü' modülünde izlenebilir.
- Saflaştırma çalışmasının tamamlanmasının ardından, elde edilen kromatogramı sistem yazılımındaki 'Değerlendirme' modülünde kontrol edin.
- Protein içeren tüm fraksiyonları ayrı bir tüpte birleştirin, tampon değişimi yapın ve 30 kDa moleküler ağırlığı kesilmiş bir santrifüj filtre cihazı kullanarak PBS'de konsantre edin. Santrifüjleme adımlarını üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirin.
- Üreticinin talimatlarına göre bikinkoninik asit testi (BCA) kullanarak antikor konsantrasyonunu ölçün.
- Başka bir saflaştırma işlemi gerçekleştirilecekse, sampBağlama tamponundaki pompa hortumu ve 1.9-1.14 adımlarını tekrarlayın.
- Saflaştırma çalışmalarının tamamlanmasının ardından, A, B ve numune pompasının giriş borularını ultra saf suya daldırın ve sistemi ve kolonu 3. adımda yapıldığı gibi yıkayın.
- A, B ve numune pompası borusunu %20 etanole batırın ve sistemin ve kolonun depolanması için yıkama prosedürünü tekrarlayın.
- Kolonu aşağı akış çıkışından ayırın ve kolon durdurucuyu değiştirin, ardından girişteki kolonun bağlantısını kesin ve durdurucuyu değiştirin, boruyu sisteme yeniden bağlayın. Kolonu 4 °C'de saklayın.