Erişkin Hipokampal Nörojenezi Tespit Etmek için Bir İmmünofloresan Boyama Tekniği

Özet

Kaynak: Ansorg, A., et al. Yetişkin Hipokampal Nörojenezi İncelemek İçin Aynı Konakçı Türden Antikorlarla İmmünohistokimya ve Çoklu Etiketleme. J. Vis. Uzm. (2015)

Video, yetişkin hipokampusundaki nörojenezi incelemek için kullanılan bir immünofloresan boyama yöntemini göstermektedir. Başlangıçta, bir fare beyin bölümü, nöronal progenitör hücrelerde nörojenez ile ilişkili işaretleyici proteinlere yönelik birincil antikorlarla tedaviye tabi tutulur. Daha sonra, floroforlarla etiketlenmiş ikincil antikorlarla etiketlenir. Beyin bölümü daha sonra, işaretleyici proteinlerin farklı kombinasyonlarının ekspresyon modellerine dayalı olarak, progenitör hücrelerin çeşitli alt tiplerini ayırt etmek için konfokal bir mikroskop altında gözlemlenir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Doku Hazırlama

1. Perfüzyondan bir gün önce 0.1 M fosfat tampon pH 7.4'te% 4 formaldehit hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
2. Derin anestezi uygulanmış fareleri (% 3.5 izofluran) sol ventrikül yoluyla 10 ml buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS), ardından 40 ml buz gibi soğuk formaldehit (akış hızı 5 ml / dak) ile transkardiyal olarak perfüze edin. Beyni inceleyin ve aynı fiksatifte 4 ° C'de 24 saat boyunca
düzeltin.
3. Beyinleri art arda %10 (4°C'de 24 ....

Sonuçlar

Şekil 1. Mikrotom dilimlerinin 24 oyuklu bir plakaya aktarılmasının şematik gösterimi. A1'den başlayın ve sonraki dilimleri A satırına yerleştirin; A6'dan sonra bir sonraki B satırına gidin ve bu şekilde devam edin. D6'ya ulaştığınızda A1'e geri dönün ve devam edin. Dilimlerin bu şekilde düzenlenmesi, tüm beynin her^n'inci bölümünün nicelleştirilmesine izin verir. Yenidoğan hücrelerin nicell.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Doku hazırlama
İzofluran-Actavis	Piramal Sağlık	700211
Paraformaldehit tozu (PFA)	Riedel-de Häen	16005	toksik, yanıcı
Perfüzyon pompası PD5206	Heidolph Aletleri	523-52060-00
Masterflex Tygon laboratuvar hortumu, Ø 0,8 mm	Thermo Fischer Bilimsel	06409-13
Besleme iğnesi, düz, 21 G, 1,75 mm zeytin ucu, 40 mm	Agnthos (Ağntüs)	1036
Dondurucu mikrotom Mikrom HM 400	Thermo Fischer Bilimsel
24 oyuklu Hücre kültürü çok kuyulu plakalar	Greiner Bio-Bir	662160
İmmünohistokimya
Tefal vitacuisine vapuru	Tefal	4001'e KARŞI
Netwell 24 mm polyester örgü membran ekleri	Corning	3479	6 oyuklu kültür plakalarına önceden yüklenmiş
Netwell 15 mm polyester örgü membran ekleri	Corning	3477	12 oyuklu kültür plakalarına önceden yüklenmiş
Netwell plastik 6 kuyulu taşıyıcı kiti	Corning	3521	24 mm polyester örgü membran ekleri için
Netwell plastik 12 kuyulu taşıyıcı kiti	Corning	3520	15 mm polyester örgü membran ekler için
Vectastain Elite ABC kiti	Vektör Laboratuvarları	PK-6100
DAB (3,3" -Diaminobenzidin tetrahidroklorür hidrat)	Sigma-Aldrich	D-5637	kanserojen, ışığa duyarlı
Floromount-G	Güney Biyoteknoloji	0100-01
Birincil antikorlar
tavşan IgG1 α-Ki67
tavşan α-GFAP, AS-3-GF	Novocastra/ Leica Biyosistemleri	NCL-L-Ki67MM1	DAB 1:400/EĞER 1:100; epitop alımı gerektirir
keçi IgG (H+L) α-GFP	Sinaptik Sistemler	173 002	09:20
fare IgG1 α-nestin	Acris Antikorları	R1091P	06:00
kobay IgG (H + L) α-Doublecortin	Abcam Belediyesi	AB6142	1:200; epitop alımı gerektirir
sıçan IgG2a α-BrdU (asit)	Merck Kırlangıç	AB2253	09:20
sıçan IgG2a α-BrdU (saflaştırılmış)	AbD Serotec / Biyo-Rad	OBT0030CX	BrdU'nun tespiti için; DAB 1:500/EĞER 1:400
fare IgG1κ α-BrdU	AbD Serotec / Biyo-Rad	OBT0030	CldU'nun tespiti için; DAB 1:500/EĞER 1:250-400
fare IgG1 α-NeuN	BD Biyolojik Bilimler	347580	IdU'nun tespiti için; DAB 1:500/EĞER 1:350
İkincil antikorlar	Merck Kırlangıç	MAB377	09:20
eşek α-kobay IgG (H + L) -Biotin
eşek α-sıçan IgG (H + L) -Biotin	Dianova Belediyesi	711-065-152	09:20
eşek α fare IgG (H + L) -Biotin	Dianova Belediyesi	712-065-150	09:20
keçi α-sıçan IgG (H + L) -Alexa Fluor 488	Dianova Belediyesi	715-065-151	09:20
eşek α-keçi IgG (H+L)-Alexa Fluor 488	Moleküler Problar	A11006	05:10
eşek α-fare IgG (H + L) -FITC, Fab-Fragment	Moleküler Problar	A11055	05:10
eşek α-fare IgG (H + L) -Alexa Fluor 647	Dianova Belediyesi	715-097-003	02:40
eşek α-kobay IgG (H+L)-Alexa Fluor 647	Dianova Belediyesi	715-605-151	05:10
eşek α-sıçan IgG (H + L) -Rhodamine Kırmızı-X	Dianova Belediyesi	706-605-148	05:10
eşek α-tavşan IgG (H+L)-Rhodamine Kırmızı-X	Dianova Belediyesi	712-295-150	05:10
eşek α-kobay IgG (H+L)-Rhodamine Red-X	Dianova Belediyesi	711-295-152	05:10
Streptavidin-Rodamin Kırmızısı-X	Dianova Belediyesi	706-296-148	05:10
keçi α-tavşan IgG (H + L) -AMCA	Dianova Belediyesi	016-290-084	09:20
Hoechst 33342	Dianova Belediyesi	111-155-144	1:250, yalnızca tavşan α-GFAP ile çalışır
DAPI (DAPI	Moleküler Problar	H3570	17:40
Engelleme	Moleküler Problar	D1306	17:40
Fab-parça eşek α-fare IgG (H + L)
Fab-parça eşek α tavşan IgG (H + L)	Dianova Belediyesi	715-007-003	01:20
Normal eşek serumu	Dianova Belediyesi	711-007-003	01:20
Normal tavşan serumu	Merck Kırlangıç	S30 Serisi
Normal keçi serumu	Dianova Belediyesi	011-000-010
Sığır Serumu Albümin	Dianova Belediyesi	005-000-001
histoloji	Sigma-Aldrich	A7906
Kresil menekşe
Neo-Şeffaf	Sigma-Aldrich	C5042
Neo-Montaj	Merck Kırlangıç	109843	toksik olmayan ksilen ikamesi
Mikroskopi	Merck Kırlangıç	109016	Kalıcı montaj ortamı
Aksiyoskop 2
LSM 710	Carl Zeiss Mikroskobu
	Carl Zeiss Mikroskobu

Belediyesi adet Serisi Gazetesi Muharebe Numarası Serisi Serisi Tezli Yazılım Serisi Serisi ) Serisi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Serisi