Erişkin Hipokampal Nörojenezi Tespit Etmek için Bir İmmünofloresan Boyama Tekniği

Özet

Kaynak: Ansorg, A., et al. Yetişkin Hipokampal Nörojenezi İncelemek İçin Aynı Konakçı Türden Antikorlarla İmmünohistokimya ve Çoklu Etiketleme. J. Vis. Uzm. (2015)

Video, yetişkin hipokampusundaki nörojenezi incelemek için kullanılan bir immünofloresan boyama yöntemini göstermektedir. Başlangıçta, bir fare beyin bölümü, nöronal progenitör hücrelerde nörojenez ile ilişkili işaretleyici proteinlere yönelik birincil antikorlarla tedaviye tabi tutulur. Daha sonra, floroforlarla etiketlenmiş ikincil antikorlarla etiketlenir. Beyin bölümü daha sonra, işaretleyici proteinlerin farklı kombinasyonlarının ekspresyon modellerine dayalı olarak, progenitör hücrelerin çeşitli alt tiplerini ayırt etmek için konfokal bir mikroskop altında gözlemlenir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Doku Hazırlama

1. Perfüzyondan bir gün önce 0.1 M fosfat tampon pH 7.4'te% 4 formaldehit hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
2. Derin anestezi uygulanmış fareleri (% 3.5 izofluran) sol ventrikül yoluyla 10 ml buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS), ardından 40 ml buz gibi soğuk formaldehit (akış hızı 5 ml / dak) ile transkardiyal olarak perfüze edin. Beyni inceleyin ve aynı fiksatifte 4 ° C'de 24 saat boyunca
düzeltin.
3. Beyinleri art arda %10 (4°C'de 24 saat) ve %30 sükroz (beyin batana kadar, yaklaşık 48 saat) içine aktarın. Dondurmak için, kriyo korumalı beyinleri dokudan kabarcık çıkmayana kadar yavaşça -25 °C izopentanın içine daldırın. -80 °C'de saklayın.
4. Dondurucu bir mikrotom üzerinde 40 μm kalınlığında koronal bölümler kesin (-25 ila -16 ° C'de blok sıcaklığı). Bölümleri, 24 oyuklu bir hücre kültürü plakasının kuyucuklarını içeren antifriz çözeltisine sırayla aktarın (bkz. Şekil 1). -20 °C'de saklayın.

2. İmmün boyama

>NOT: Bölümler, genellikle bir taşıyıcı plaka ve ağ ekleri ile donatılmış 6 oyuklu plakalarda serbest yüzer olarak işlenir. İstisna olarak, blokaj, antikor inkübasyonları ve avidin-biyotin kompleksi (ABC) reaksiyonları, ağ ekleri olmadan 12 veya 24 oyuklu plakalarda yapılır (boyanması gereken dilim sayısına bağlı olarak oyuk başına 0,5 ila 1 ml yeterlidir). Bu adımlar sırasında, ince bir fırça yardımıyla bölümleri aktarın (her yeni solüsyonla durulayın). Tüm inkübasyonlar sürekli çalkalama ile yapılır (maks. 150 rpm).

1. İmmünohistokimya (ABC yöntemi)
   1. Antifriz bölümlerini tris-tamponlu tuzlu suya (TBS) aktarın ve antifrizi tamamen çıkarmak için iyice durulayın (4 °C'de bir kez O/N, her biri 10 dakika boyunca oda sıcaklığında [RT] 5 kez).
   2. Endojen peroksidaz aktivitesini söndürmek için, TBS-Tween 20'de (TBS-T)% 1.5_H2O2'de 30 dakika inkübe edin. Köpürmeye dikkat edin ve gerekirse bölümleri yeniden batırın. TBS'de her biri 15 dakika boyunca 3 kez durulayın.
   3. İsteğe bağlı: Bu arada, bir ısıtma kabinini ve 2 N HCl'yi 37 °C'ye önceden ısıtın. DNA'yı denatüre etmek için, bölümleri 37 ° C'de 2 N HCl'de 30 dakika inkübe edin.
   4. İsteğe bağlı: Bölümleri 0,1 M borat tamponunda 10 dakika boyunca nötralize edin pH 8.5, RT. Aktarma sırasında, HCl kalıntılarını çıkarmak için bölümleri içeren ağ eklerini bir kağıt havlu üzerinde kısa bir süre temizleyin. TBS'de her biri 15 dakika boyunca 2 kez durulayın.
   5. Dokuya nüfuz etmek ve RT'de 1 saat boyunca spesifik olmayan antikor bağlanma bölgelerini bloke etmek için TBSplus'ta inkübe edin.
   6. TBSplus, O/N içinde 4 ° C'de seyreltilmiş birincil antikorda inkübe edin. TBS'de her biri 15 dakika boyunca 3 kez durulayın.
   7. RT'de 3 saat boyunca TBSplus'ta seyreltilmiş biyotinile ikincil antikor içinde inkübe edin. TBS'de her biri 15 dakika boyunca 3 kez durulayın. Bu arada...
   8. ABC kompleksini üreticinin protokolüne göre hazırlayın (TBS-T'de% 1 A +% 1 B). Kullanmadan önce RT'de 30 dakika bekletin. Bölümleri AB reaktifinde RT'de 1 saat inkübe edin. TBS'de her biri 15 dakika boyunca 3 kez durulayın.
   9. 6 veya 12 oyuklu plaka başına TBS-T'de 50 ml 0.5 mg / ml 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) hazırlayın, iki yarıya bölün ve oyuk başına sırasıyla 4 ml veya 2 ml pipetleyin. Bölümleri DAB çözeltisine aktarın (DİKKAT! DAB toksiktir. Tedarikçi tarafından sağlanan özel MSDS'yi takip edin, yani laboratuvar önlüğü ve eldiven giyin ve kimyasal davlumbaz kullanın).
   10. Kalan 25 ml DAB çözeltisine 0.5 ml% 1 H₂O₂ ekleyin, peroksidaz reaksiyonunu başlatmak için her bir oyuğa yukarıdaki gibi eşdeğer hacimleri karıştırın ve pipetleyin. 12 dakika inkübe edin. TBS'de her biri 15 dakika boyunca 3 kez durulayın.
   11. Bölümleri jelatin ve havayla kuruyan O/N içindeki slaytlara monte edin. Kalıcı montaj ortamına sahip lamel.
   12. İsteğe bağlı: Lameli yerleştirmeden önce karşı leke.
       not: Yüksek arka plan nedeniyle sinyal-gürültü oranı düşükse, AB reaktifi ile inkübasyondan sonra H₂O₂ işlemini tekrarlayın (adım 2.1.8).
2. Çoklu immünofloresan
   1. Tek veya eşzamanlı çoklu immünofloresan
      1. Antifriz bölümlerini TBS'ye aktarın ve antifrizi tamamen çıkarmak için iyice durulayın (4 °C'de bir kez O/N, her biri 10 dakika boyunca RT'de 5 kez).
      2. İsteğe bağlı: 2.1.3 - 2.1.4 adımları gibi.
      3. Dokuyu geçirgen hale getirmek ve spesifik olmayan antikor bağlanma bölgelerini bloke etmek için RT'de 1 saat TBSplus'ta inkübe edin.
      4. Birincil antikor kokteylinde inkübe edin (ör., sıçan α-BrdU (bromodeoksiuridin), kobay α-DCX (doublecortin), keçi α-GFP (yeşil floresan protein)) TBSplus, O / N'de 4 ° C'de seyreltilmiş. TBS'de her biri 15 dakika boyunca 3 kez durulayın.
      5. Florokrom konjuge ikincil antikorlardan oluşan bir kokteylde inkübe edin (ör., Rhodamine Red α-sıçan, Alexa-647 α-kobay, Alexa-488 α-keçi; hepsi eşekten türetilmiştir) TBSplus'ta seyreltilmiş, RT'de 3 saat veya 4 ° C'de O / N. Şu andan itibaren bölümleri ışıktan koruyun. TBS'de her biri 15 dakika boyunca 3 kez durulayın.
      6. Bölümleri jelatin içindeki slaytlara monte edin ve gece boyunca havayla kurutun (O/N). Sulu montaj ortamı ile lamel
   2. Aynı konakçı türden primer antikorlarla ardışık çoklu immünofloresan
      1. Adım olarak 2.2.1.1 - 2.2.1.3.
      2. İlk primer antikorda inkübe edin (ör., tavşan α-antijen A), 4 ° C'de O / N. TBS'de 3 kez ve TBS-T'de bir kez 10 dakika durulayın.
      3. İlk florokrom konjuge ikincil antikorda inkübe edin (ör., Rhodamine Red-conj. eşek α-tavşan), 3 saat RT. Şu andan itibaren, bölümleri ışıktan koruyun. TBS'de 3 kez ve TBS-T'de bir kez 10 dakika durulayın.
      4. Primer antikorlarla aynı konakçıdan% 10 normal serumda inkübe edin (ör., tavşan serumu) ilk ikincil antikor üzerindeki açık paratopları doyurmak için 3 saat RT için. TBS'de 3 kez ve TBS-T'de bir kez 10 dakika durulayın.
      5. TBSplus'ta 50 μg / ml konjuge olmayan monovalent Fab fragmanları ile birincil antikorların konakçısına karşı inkübe edin (ör., α-tavşan IgG (H + L)) ikinci ikincil antikor, 4 ° C'de O / N tarafından tanınabilen epitopları kaplamak için.
      6. TBS'de en az 3 kez ve TBS-T'de bir kez 10 dakika durulayın. Aktarma sırasında, Fab kalıntılarını çıkarmak için bölümleri içeren ağ eklerini bir kağıt havlu üzerinde kısa bir süre sürün.
      7. İkinci primer antikorda inkübe edin (ör., tavşan α-antijen B), 4 ° C'de O / N. TBS'de 3 kez ve TBS-T'de bir kez 10 dakika durulayın.
      8. İkinci florokrom konjuge ikincil antikorda inkübe edin (örneğin, Alexa-488-conj. eşek α-tavşan), 3 saat RT. TBS'de her biri 15 dakika boyunca 3 kez durulayın, yukarıdaki gibi monte edin ve lamel yapın.
         not: Antijenleri farklı konakçı türlerden gelen antikorlarla etiketlemek için, bunları adım 2.2.2.2'ye ve ilgili ikincil antikorları adım 2.2.2.3'e ekleyin.

Sonuçlar

Şekil 1. Mikrotom dilimlerinin 24 oyuklu bir plakaya aktarılmasının şematik gösterimi. A1'den başlayın ve sonraki dilimleri A satırına yerleştirin; A6'dan sonra bir sonraki B satırına gidin ve bu şekilde devam edin. D6'ya ulaştığınızda A1'e geri dönün ve devam edin. Dilimlerin bu şekilde düzenlenmesi, tüm beynin her^n'inci bölümünün nicelleştirilmesine izin verir. Yenidoğan hücrelerin nicell...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Doku hazırlama
İzofluran-Actavis	Piramal Sağlık	700211
Paraformaldehit tozu (PFA)	Riedel-de Häen	16005	toksik, yanıcı
Perfüzyon pompası PD5206	Heidolph Aletleri	523-52060-00
Masterflex Tygon laboratuvar hortumu, Ø 0,8 mm	Thermo Fischer Bilimsel	06409-13
Besleme iğnesi, düz, 21 G, 1,75 mm zeytin ucu, 40 mm	Agnthos (Ağntüs)	1036
Dondurucu mikrotom Mikrom HM 400	Thermo Fischer Bilimsel
24 oyuklu Hücre kültürü çok kuyulu plakalar	Greiner Bio-Bir	662160
İmmünohistokimya
Tefal vitacuisine vapuru	Tefal	4001'e KARŞI
Netwell 24 mm polyester örgü membran ekleri	Corning	3479	6 oyuklu kültür plakalarına önceden yüklenmiş
Netwell 15 mm polyester örgü membran ekleri	Corning	3477	12 oyuklu kültür plakalarına önceden yüklenmiş
Netwell plastik 6 kuyulu taşıyıcı kiti	Corning	3521	24 mm polyester örgü membran ekleri için
Netwell plastik 12 kuyulu taşıyıcı kiti	Corning	3520	15 mm polyester örgü membran ekler için
Vectastain Elite ABC kiti	Vektör Laboratuvarları	PK-6100
DAB (3,3" -Diaminobenzidin tetrahidroklorür hidrat)	Sigma-Aldrich	D-5637	kanserojen, ışığa duyarlı
Floromount-G	Güney Biyoteknoloji	0100-01
Birincil antikorlar
tavşan IgG1 α-Ki67
tavşan α-GFAP, AS-3-GF	Novocastra/ Leica Biyosistemleri	NCL-L-Ki67MM1	DAB 1:400/EĞER 1:100; epitop alımı gerektirir
keçi IgG (H+L) α-GFP	Sinaptik Sistemler	173 002	09:20
fare IgG1 α-nestin	Acris Antikorları	R1091P	06:00
kobay IgG (H + L) α-Doublecortin	Abcam Belediyesi	AB6142	1:200; epitop alımı gerektirir
sıçan IgG2a α-BrdU (asit)	Merck Kırlangıç	AB2253	09:20
sıçan IgG2a α-BrdU (saflaştırılmış)	AbD Serotec / Biyo-Rad	OBT0030CX	BrdU'nun tespiti için; DAB 1:500/EĞER 1:400
fare IgG1κ α-BrdU	AbD Serotec / Biyo-Rad	OBT0030	CldU'nun tespiti için; DAB 1:500/EĞER 1:250-400
fare IgG1 α-NeuN	BD Biyolojik Bilimler	347580	IdU'nun tespiti için; DAB 1:500/EĞER 1:350
İkincil antikorlar	Merck Kırlangıç	MAB377	09:20
eşek α-kobay IgG (H + L) -Biotin
eşek α-sıçan IgG (H + L) -Biotin	Dianova Belediyesi	711-065-152	09:20
eşek α fare IgG (H + L) -Biotin	Dianova Belediyesi	712-065-150	09:20
keçi α-sıçan IgG (H + L) -Alexa Fluor 488	Dianova Belediyesi	715-065-151	09:20
eşek α-keçi IgG (H+L)-Alexa Fluor 488	Moleküler Problar	A11006	05:10
eşek α-fare IgG (H + L) -FITC, Fab-Fragment	Moleküler Problar	A11055	05:10
eşek α-fare IgG (H + L) -Alexa Fluor 647	Dianova Belediyesi	715-097-003	02:40
eşek α-kobay IgG (H+L)-Alexa Fluor 647	Dianova Belediyesi	715-605-151	05:10
eşek α-sıçan IgG (H + L) -Rhodamine Kırmızı-X	Dianova Belediyesi	706-605-148	05:10
eşek α-tavşan IgG (H+L)-Rhodamine Kırmızı-X	Dianova Belediyesi	712-295-150	05:10
eşek α-kobay IgG (H+L)-Rhodamine Red-X	Dianova Belediyesi	711-295-152	05:10
Streptavidin-Rodamin Kırmızısı-X	Dianova Belediyesi	706-296-148	05:10
keçi α-tavşan IgG (H + L) -AMCA	Dianova Belediyesi	016-290-084	09:20
Hoechst 33342	Dianova Belediyesi	111-155-144	1:250, yalnızca tavşan α-GFAP ile çalışır
DAPI (DAPI	Moleküler Problar	H3570	17:40
Engelleme	Moleküler Problar	D1306	17:40
Fab-parça eşek α-fare IgG (H + L)
Fab-parça eşek α tavşan IgG (H + L)	Dianova Belediyesi	715-007-003	01:20
Normal eşek serumu	Dianova Belediyesi	711-007-003	01:20
Normal tavşan serumu	Merck Kırlangıç	S30 Serisi
Normal keçi serumu	Dianova Belediyesi	011-000-010
Sığır Serumu Albümin	Dianova Belediyesi	005-000-001
histoloji	Sigma-Aldrich	A7906
Kresil menekşe
Neo-Şeffaf	Sigma-Aldrich	C5042
Neo-Montaj	Merck Kırlangıç	109843	toksik olmayan ksilen ikamesi
Mikroskopi	Merck Kırlangıç	109016	Kalıcı montaj ortamı
Aksiyoskop 2
LSM 710	Carl Zeiss Mikroskobu
	Carl Zeiss Mikroskobu

Belediyesi adet Serisi Gazetesi Muharebe Numarası Serisi Serisi Tezli Yazılım Serisi Serisi ) Serisi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Serisi