$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Hayvan hazırlama
- % 3 izofluran kullanarak fareleri uyuşturun. Orta karnın üzerindeki bölgede yatay bir kesi yaparak ve cildi çekerek göğsü açın. Başka organları delmeden göğüs boşluğunu açmak için dikkatlice başka bir kesi yapın.
- Tam miyokardiyal gevşeme sağlamak için kardiyoplejik solüsyonda (50 mM KCl, PBS'de %5 dekstroz, bkz. Tablo 1) soğuk %3 glutaraldehit kullanarak kalbi önce apeksten ve ardından sağ ventrikülden 2 dakika boyunca perfüze edin.
- 0,1 M sodyum kakodilat tamponunda (pH 7,4) buz gibi %3 glutaraldehit kullanarak kalbi 2 dakika daha perfüze edin. Yerçekimi basıncını kullanarak, fiksatifleri kalbe sokmak için 25 G 5/8 "iğne kullanın. Kalp fiksatif ile dolmaya başladıktan hemen sonra, kalbin tepesini yukarı kaldırın ve basıncı azaltmak ve sıvıların boşalmasına izin vermek için kalpten 1-2 mm uzakta altındaki damarları kesin.
- Kalbi disseke edin, kulakçıkları çıkarın ve ventrikülleri bir Petri kabında buz gibi soğuk %3 glutaraldehit/0.1 M sodyum kakodilata bırakın. 30-60 dakikalık fiksasyondan sonra bir kelebek kesimi yapın ve %3 glutaraldehit/kakodilat içeren bir Petri kabına yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu). Kalbi glutaraldehit/kakodilat çözeltisi içindeyken 1 mm3'lük küçük küpler halinde cerrahi bir bıçak kullanarak doğrayın.
- Diseke kalp dokusunu 4 ° C'de 24 saat boyunca glutaraldehit/kakodilat çözeltisine sabitleyin/daldırın.
2. Kalp dokusu işleme
- 24 saatlik fiksasyondan sonra, dokuları 20 dakika boyunca 0.1 M sodyum kakodilat tamponunda yıkayın.
- Aşağıdaki adımları izleyerek 0.1 M kakodilat tamponu hazırlayın.
- 0.1 M sodyum kakodilat tamponu hazırlamak için, sodyum kakodilat (21.4 g) ve% 1 kalsiyum klorür çözeltisini (3 mL) 90 mL damıtılmış suda çözerek 1 M sodyum kakodilat tamponu stoğu hazırlayın. Damıtılmış suyu ekleyerek çözeltiyi 100 mL'ye yükseltin. Çözeltiyi iyice karıştırın ve çözünen maddeyi çözmek için gece boyunca bırakın.
- Daha sonra, 10 mL 1 M sodyum kakodilat stok çözeltisi alın ve 80 mL damıtılmış suya ekleyin. HCl kullanarak pH'ı 7.4'e ayarlayın ve damıtılmış su ekleyerek 100 mL'ye kadar ses çıkarın.
- Yıkamayı 0.1 M sodyum kakodilat tamponunda 20 dakika daha tekrarlayın. Dokuları sodyum kakodilat tamponundan çıkarın ve oda sıcaklığında 4 saat boyunca% 2 osmiyum tetroksit çözeltisine daldırın. Bu işleme osmikasyon denir.
- Aşağıdaki adımları izleyerek% 2 Osmiyum tetroksit çözeltisi hazırlayın.
- % 2 Osmiyum tetroksit çözeltisi hazırlamak için,% 4 Osmiyum tetroksit çözeltisi, 4 mL (Malzeme Tablosuna bakınız), 1 M sodyum kakodilat stok çözeltisi (0.8 mL) ve damıtılmış su (3.2 mL) alarak toplam 8 mL çözelti elde edin.
not: Tüm bu süreç ve bundan sonraki adımlar çeker ocakta gerçekleştirilmelidir.
- Osmikasyondan sonra, dokuları oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 2 sodyum asetat çözeltisine batırın.
- 4 g sodyum asetatı 20 mL damıtılmış suda çözerek% 2 sodyum asetat çözeltisi hazırlayın.
- Daha sonra, dokuları oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 2 uranil asetat çözeltisine batırın.
- 4 g uranil asetatı 20 mL damıtılmış suda çözerek% 2 uranil asetat çözeltisi hazırlayın.
- Uranil asetat boyamadan sonra, dokuları Tablo 2'de belirtilen sırayla dereceli alkoller ve aseton yoluyla sırayla kurutun.
3. Kalp dokusu gömme
- Susuz kalmış dokuları aşağıdaki adımları izleyerek düşük viskoziteli epoksi reçineye gömün.
- Düşük viskoziteli epoksi reçine yapmak için, 10.24 mL vinil sikloheksen dioksit epoksi monomeri, 6.74 mL diglisidil eter polipropilen glikol (DER 732) ve 30.05 mL nonenil süksinik anhidrit (NSA) karıştırın (bkz. Süspansiyonu 2 dakika boyunca elle iyice karıştırın.
- 18 damla 2-dimetilaminoetanol (DMAE, Malzeme Tablosuna bakınız) epoksi hızlandırıcı ekleyin ve bileşenleri iyice karıştırmak için süspansiyonu karıştırın.
- Dokuları epoksi reçine içinde aşağıdaki karışım sırasına göre emprenye edin.
- % 100 asetonu 1: 1 reçine ile değiştirin: aseton süspansiyonu ve dokuları oda sıcaklığında 1 saat boyunca içine daldırın.
- 1: 1 reçine: aseton süspansiyonunu 6: 1 reçine ile değiştirin: aseton süspansiyonu ve dokuları 3 saat boyunca içine daldırın.
- Son olarak, 6:1 reçine: aseton süspansiyonunu %100 reçine süspansiyonu ile değiştirin ve dokuları gece boyunca oda sıcaklığında içine daldırın.
- Dokuları 8 mm'lik mikro kalıplarda taze reçineye koyun (Malzeme Tablosuna bakınız) ve gömülü dokuları gece boyunca 70 °C'de kürleyin.
not: Sertleştikten sonra reçinenin sert olduğundan ancak kırılgan olmadığından emin olun.
4. Ultramikrotom kullanarak doku kesiti alma
- Ultramikrotom üzerine monte etmeden önce reçine bloklarını doku ile birlikte 1 mm'den büyük olmayacak şekilde kesin (bkz. Malzeme Tablosu). Kalıbı ultramikrotomun segmentli koluna mümkün olduğunca hassas bir şekilde yerleştirin ve numune kalıbını manuel olarak elmas bıçağa doğru ilerletin.
- Kesitleri bir Histo bıçağıyla 500 nm (yarım mikron) kalınlığında kesin (Malzeme Tablosuna bakın) ve EM döngü aracını kullanarak bunları alın ve bir cam slayt üzerine yerleştirin.
- İlgilenilen alanı bulmak için cam slaytı toluidin mavisi lekesi için sıcak bir plakaya yerleştirin.
- İlgilendiğiniz alanı bulduktan sonra, soluk altın ultra ince kesitler (100 nm) üretmek için Ultra 45° bıçak (Malzeme Tablosuna bakın) kullanın. Bu ultra ince bölümleri 200 gözenekli bir bakır ızgaranın donuk tarafına yerleştirin.
5. Ultra ince kalp bölümü boyama
- Bir aşındırma solüsyonu, yani %5 sodyum meta-periodat solüsyonu kullanarak antijenin maskesini kaldırarak boyamaya başlayın.
- Damıtılmış suda 500 μL% 5 sodyum metaperiodat (Malzeme Tablosuna bakınız) çözeltisi hazırlayın.
not: Kullanmadan önce taze çözelti hazırlayın.
- Temiz bir parafin film üzerine 20 μL sodyum metaperiodat çözeltisi koyun. Tamamen kurutulmuş ızgaraları, doku kesitleri ile aşındırma çözeltisinin damlacığı üzerine yerleştirin.
not: Doku bölümü ile ızgaranın donuk tarafı, aşındırma çözeltisine doğru bakmalıdır.
- Kesit ızgarasını oda sıcaklığında 30 dakika çözelti üzerinde bırakın.
- Kazınmış doku bölümünü 60 saniye boyunca bir damla damıtılmış su üzerine koyarak yıkayın.
- Kesit ızgaralarını oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 0.05 M glisin çözeltisi damlacığı üzerine yerleştirerek kalan aldehitleri bloke edin. Kalan glisin çözeltisini çıkarmak için ızgaranın kenarlarını filtre kağıdına kurulayın.
- 3.75 mg glisini 1 mL 1x PBS (pH 7.4) içinde çözerek 0.05 M glisin çözeltisi hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Kesit ızgaralarını oda sıcaklığında 25 dakika boyunca 10-20 μL engelleme çözeltisine yerleştirin.
not: Bloke edici çözelti bileşimi: 2 μL% 1 normal keçi serumu (NGS) + 20 μL% 1 BSA (nihai konsantrasyon:% 10) + 178 μL 1x PBS (pH 7.4) 200 μL'lik bir nihai hacim elde etmek için.
- Izgara kenarlarını filtre kağıdına kurulayın ve ızgara bölümünü 10 dakika boyunca oda sıcaklığında şartlandırmak için antikor seyrelticisine yerleştirin.
- Izgara bölümlerini birincil antikor ile (bu durumda Sigmar1, Malzeme Tablosuna bakınız; antikor seyrelticide 1:10 oranında seyreltilmiş) nemlendirilmiş bir odada 1 saat 30 dakika inkübe edin.
- Izgarayı kurulayın, kurulayın ve ızgara bölümlerini her biri 5 dakika boyunca iki kez antikor seyreltici ile yıkayın.
- Izgara bölümlerini biyotinile edilmiş ikincil antikor (bu durumda, biyotinile keçi anti-tavşan poliklonal ikincil antikoru, bkz. Malzeme Tablosu; antikor seyrelticisinde 1:10 oranında seyreltilmiş) ile nemlendirilmiş bir odada 1 saat inkübe edin.
- Izgarayı kurulayın, kurulayın ve ızgara bölümlerini her biri 5 dakika boyunca iki kez antikor seyreltici ile yıkayın.
- Izgara bölümlerini, ticari olarak temin edilebilen streptavidin konjuge QD'de (QD655nm, Malzeme Tablosuna bakınız; antikor seyrelticisinde 1:10 oranında seyreltilmiş) oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odada 1 saat inkübe edin. Hazneyi alüminyum folyo ile kaplayarak ışığa maruz kalmayı önleyin.
- Izgara kenarlarını filtre kağıdı kullanarak kurulayın ve ızgara kısımlarını su damlacıkları üzerine koyarak 2 dakika boyunca yıkayın.
- Kuruması için ızgaranın kenarlarını kurulayın.
Tablo 1: Doku dehidrasyonu için kullanılan PBS ve diğer çözeltilerin bileşimi.
| arabellek | kompozisyon | miktar |
| Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS) (1x) (1 L) | Sodyum Klorür | 8 gr |
| Potasyum Klorür | 0.2 gr |
| Sodyum Fosfat dibazik | 1.44 gr |
| Potasyum Fosfat monobazik | 0.24 gr |
| PH'ı 7.4'e ayarlayın | |
Tablo 2: Doku dehidrasyonu için dereceli alkol ve aseton uygulaması (Adım 2.5)
| parça | Saat |
| % 50 etanol | 10 dk |
| % 70 etanol | 10 dk |
| % 95 etanol | 10 dk |
| % 100 etanol | 20 dk |
| % 100 etanol | 20 dk |
| %100 aseton | 30 dk |
| %100 aseton | 30 dk |