$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Hayvan hazırlama ve böbrek fiksasyonu
- Aşağıdaki adımları izleyerek perfüzyon fiksasyonu gerçekleştirin.
- İzofluran (% 3, 2.0 L / dak) soluyarak ve medetomidin hidroklorür (0.3 mg / kg), butorphanol tartrat (5 mg / kg) ve midazolamın (4 mg / kg) intraperitoneal uygulamasıyla fareyi uyuşturun (bkz.
- Hayvanı kalbin sol ventrikülünden fosfat tamponunda (PB) 20 mL fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4) ve 30 mL %4 paraformaldehit (PFA) ile perfüze edin.
- Daldırma fiksasyonunu perfüzyon fiksasyonu ve böbrek örneklemesinden hemen sonra gerçekleştirin.
- Böbreği 4 ° C'de 16 saat daha %4 PFA'ya daldırın, ardından 2 saat (üç kez) PBS ile yıkayın9 (Şekil 1).
Dikkat: Formaldehit ve paraformaldehit toksik tahriş edici maddelerdir. Reaktifleri uygun kişisel koruyucu ekipmanla bir çeker ocakta kullanın.
2. Renk giderme ve delipidasyon
- Ağırlıkça %10 Triton X-100 ve ağırlıkça %10 N-butildietanolamin'den oluşan renk giderme ve delipidasyon için CUBIC-L'yi (Açık, Engelsiz Beyin / Vücut Görüntüleme Kokteylleri ve Hesaplamalı analiz) hazırlayın (bkz.
- Aşağıdaki adımları izleyerek CUBIC-L ile renk giderme ve delipidasyon gerçekleştirin.
- Sabit böbreği 7 mL %50 (h/h) CUBIC-L'ye (1: 1 su ve CUBIC-L karışımı) 14 mL'lik yuvarlak tabanlı bir tüpe daldırın (Malzeme Tablosuna bakınız) oda sıcaklığında 6 saat boyunca hafifçe çalkalayarak (Şekil 2A). Ardından, 5 gün boyunca 37 ° C'de hafifçe çalkalayarak 14 mL yuvarlak tabanlı bir tüpte 7 mL CUBIC-L'ye daldırın.
- Bu işlem sırasında CUBIC-L'yi her gün yenileyin. Renk giderme ve delipidasyon işleminden sonra, böbreği PBS ile oda sıcaklığında 2 saat (üç kez) yıkayın (Şekil 1). Numune işleme için bir dağıtım kaşığı kullanın (Şekil 2B).
3. Tam montajlı immünofloresan boyama
- Boyama tamponlarını hazırlayın.
- % 0.5 (h / h) Triton X-100,% 0.5 PBS'de% 0.5 kazein ve% 0.05 sodyum azidi karıştırarak birincil antikorlar için boyama tamponunu hazırlayın.
- PBS'de %0.5 (h/h) Triton X-100, %0.1 kazein ve %0.05 sodyum azidi karıştırarak ikincil antikorlar için boyama tamponunu hazırlayın.
- Primer antikorlarla boyama yapın.
- Delipidlenmiş böbreği primer antikorlarla (1:100 veya 1:200, Malzeme Tablosuna bakınız) 37 ° C'de boyama tamponunda 7 gün boyunca hafifçe çalkalayarak immün boyayın.
not: Bir böbrek için gerekli olan boyama tamponu miktarı 500-600 μL'dir (Şekil 2C).
- Böbreği oda sıcaklığında oda sıcaklığında% 0.5 (h / h) Triton X-100 (PBST) ile 1 gün yıkayın (Şekil 1).
- İkincil antikorlarla boyama yapın.
- Böbreği ikincil antikorlarla (1:100 veya 1:200, bkz. Malzeme Tablosu) 37 ° C'de boyama tamponunda 7 gün boyunca hafifçe çalkalayarak immün boyayın. Böbreği PBST ile oda sıcaklığında 1 gün boyunca yıkayın (Şekil 1).
- Fiksasyon sonrası, böbreği 3 saat boyunca PB'de (1:36 %37 formaldehit ve PB karışımı) %1 formaldehit içine daldırın ve 6 saat oda sıcaklığında PBS ile yıkayın (Şekil 1).
4. Kırılma indisi (RI) eşleştirme
- CUBIC-R+'yı hazırlayın.
- Ağırlıkça %45 2,3-dimetil-1-fenil-5-pirazolon / antipirin ve ağırlıkça %30 nikotinamid karıştırarak CUBIC-R'yi hazırlayın (bkz.
- Daha önce yayınlanmış raporları takiben CUBIC-R'ye %0,5 v N-buthyldiethanolamin ekleyerek kırılma indisi (RI) eşleştirmesi için CUBIC-R+'yı hazırlayın.
- RI eşleştirmesini gerçekleştirin.
- Böbreği 7 mL %50 (h/h) CUBIC-R+ (1:1 su ve CUBIC-R +) karışımına, 14 mL'lik yuvarlak tabanlı bir tüpe daldırın ve 1 gün boyunca oda sıcaklığında hafifçe çalkalayın. Ardından, 2 gün boyunca oda sıcaklığında hafifçe çalkalayarak 14 mL'lik yuvarlak tabanlı bir tüpte 7 mL CUBIC-R+'ya daldırın (Şekil 1).
not: Böbrek, RI eşleşmesinin başlangıcında %50 CUBIC-R+ içinde yüzerken, işlem sonunda CUBIC-R+ içinde batar ve saydam hale gelir (Şekil 2D).
5. Görüntü elde etme ve yeniden yapılandırma
- Görüntü alımı sırasında (RI = 1.51) RI uyumlu böbreği silikon yağı (RI = 1.555) ve mineral yağ (RI = 1.467) (55:45) karışımına daldırın (Şekil 3).
- Özel yapım bir ışık tabakası floresan mikroskobu ile tüm böbreğin 3D görüntülerini elde edin (Malzeme Tablosuna bakınız). Tüm ham görüntü verilerini 16 bit TIFF biçiminde toplayın. Görüntüleme analiz yazılımı ile 3D olarak oluşturulmuş görüntüleri görselleştirin ve yakalayın (Imaris, Malzeme Tablosuna bakın).
