Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir,
1. Cilt Biyopsisi Toplanması
- Kalifiye bir doktorun cilt biyopsisini uygun bir klinik ortamda yapmasına izin verin.
- Deri biyopsisinin yapılacağı alanı seçin ve alkollü bir bezle temizleyin.
- Anestezik çözeltiyi 1 cc lidokain% 2 ile hazırlayın.
- İğne bölgeye paralel olacak şekilde deri altına lokal anestezi enjekte edilir.
- Anestezinin etkisini kontrol ettikten sonra, 3 mm'lik tek kullanımlık zımbayı alın ve deri altı yağına ulaşılana kadar epidermis ve dermis boyunca aşağı doğru döndürmek için rotasyonel ve hassas aşağı doğru basınç uygulayın.
- Yumruğu geri çek.
- Cilt tapasını nazikçe yukarı çekmek için tek kullanımlık forseps kullanın.
- Numunenin tabanını yağ dokusu seviyesinde kesmek için makas kullanın.
- Numuneyi 10 mL periyokat-lizin-paraformaldehit (PLP) fiksatif çözeltisi içeren bir tüpe yerleştirin.
- Alanı dezenfekte edin ve yapışkan bir bandajla örtün.
2. Doku Fiksasyonu ve Saklanması
- Taze PLP fiksatif solüsyonu yapın (bakınız Tablo 1).
- Deri biyopsisinin toplanmasından hemen sonra, 10 mL PLP fiksatif solüsyon içeren bir tüpe daldırın ve gece boyunca (O / N) 4 ° C'de inkübe edin.
- Ertesi gün, çeker ocak altında, PLP fiksatifini nazikçe ve aynı tüpte çıkarın, biyopsiyi 5 mL 0.1 M Sorensen çözeltisi ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın (Tablo 1).
- Sorensen solüsyonunu atın ve biyopsiyi 4 ° C'de 5 mL kriyo-koruyucu solüsyon O / N ile inkübe edin.
- Kriyotom ile kesi 1 hafta içinde yapılırsa biyopsiyi 4 °C'de saklayın; kesim 3 ay içinde yapılırsa biyopsiyi -20 °C'de saklayın; biyopsiyi bir kriyokalıba yerleştirin (adım 3.2-3.4) ve daha uzun süre saklamak için -80 °C'de saklayın.
3. Kriyotom ile Doku Kesimi
- Kriyotomu -20 °C'ye ayarlayın.
- Bir kriyo kalıp alın ve kriyo gömme ortamı ile doldurun. Baloncuk oluşturmaktan kaçının.
- Cımbız kullanarak biyopsiyi, uzunlamasına eksen (epidermis - dermis) kriyo kalıbın dibine paralel olacak şekilde kriyo gömme ortamına daldırın.
- Biyopsiyi doğru yönde içeren katı bir kriyo gömme ortamı küpü elde etmek için numuneyi sıvı nitrojen ile dondurun.
- Numuneyi kriyostata koyun ve biyopsinin iklime alışması için 30 dakika bekleyin.
- Numuneyi kriyostat üzerine sabitleyin ve 50 μm'lik bölümleri kesin.
- Küçük bir fırça yardımıyla, kriyo kesitlerini her bir oyukta 200 μL antifriz çözeltisi içeren 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Kuyu başına bir bölüm.
- -20 °C.
'de saklayın
not: Biyopsinin tamamı analiz edilmezse, sadece kısmen kesin. Bu durumda, biyopsinin daha uzun süre saklanması için kesitler -20 °C'de ve biyopsinin kalan kısmı -80 °C'de saklanmalıdır.
4. İmmünofloresan Boyama
- 96 oyuklu bir plakayı 100 μL yıkama solüsyonu ile doldurun.
- Analiz edilecek bölümleri saklama plakasından yıkama solüsyonunu içeren yeni plakaya aktarın. Her kuyucuk için 1 bölüm (anatomik bölge başına 4 bölüm, hasta başına: genellikle hasta başına toplam 12 bölüm).
- Bölümü yıkama solüsyonunda oda sıcaklığında (RT) 10 dakika bekletin. Bölümü aynı çözeltiyi içeren başka bir kuyucuğa aktarın ve yıkamayı tekrarlayın.
- Bölümleri 100 μL Engelleme çözeltisi içeren yeni kuyucuklara taşıyın ve RT'de en az 90 dakika ve en fazla 4 saat inkübe edin.
- Çalışma solüsyonunda anti-PGP9.5 (Tavşan poliklonal, 1:1000) ve anti-5G4 (Fare monoklonal, 1:400) birincil antikorlarını seyreltin.
- Bölümleri, birincil antikorların çalışma çözeltisinin 100 μL'sini içeren yeni oyuklara aktarın ve bunları RT'de O/N inkübe edin.
- Adım 4.3 olarak, bölümleri RT'de en az 10 dakika boyunca 100 μL yıkama solüsyonu ile 2 kez yıkayın.
- İkincil antikorları (farklı floroforlarla eşlenik), PGP9.5'i (1:700) tespit etmek için Keçi anti-Tavşanını ve çalışma solüsyonunda 5G4'ü (1:700) tespit etmek için bir Keçi anti-Faresini seyreltin.
- Bölümleri, RT'de 90 dakika boyunca ikincil antikorların çalışma çözeltisinin 100 μL'sini içeren yeni kuyucuklara aktarın. Bu noktadan sonra, ikincil antikor/iler ile konjuge floroforun ağartılmasını önlemek için 96 oyuklu plakayı alüminyum folyo ile örtün.
- Adım 4.3 olarak, bölümleri 100 μL yıkama solüsyonu ile en az 10 dakika boyunca 2 kez yıkayın.
- Bölümleri, RT'de 5 dakika boyunca 100 μL 4 ", 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, fosfat tamponlu salin [PBS] 1x içinde 1: 5.000 seyreltilmiş) içeren yeni kuyucuklara aktarın.
- Adım 4.3 olarak, bölümleri 100 μL yıkama solüsyonu ile en az 10 dakika boyunca 2 kez yıkayın.
- Yanlış katlamayı önlemek için bölümleri doğru konumda bir kızak üzerine monte edin.
- Sürgünün üzerine birkaç damla montaj ortamı ekleyin ve bir lamel ile örtün.
- Konfokal/floresan mikroskobunu kullanmadan önce slaytların kurumasını bekleyin.
- Slaytları ışığa maruz kalmaktan kaçınarak 4 °C'de uygun bir kutuda saklayın. Doğru bir şekilde saklanırsa, sinyal yaklaşık 6 ay boyunca görünür olacaktır.
not: Yeni kesilmiş dilimleri içeren 96 oyuklu plakadan bir kesitin, yıkama solüsyonunu içeren 96 oyuklu plakaya aktarılması (adım 4.1), biyopsinin alınmasına yardımcı olan küçük bir fırça kullanılarak gerçekleştirilir. Bölümün ilk kuyucuğa aktarılmasından sonra, dilimin farklı bir çözelti ile inkübe edilmesi gerektiğinde, fırça yardımıyla kuyudan kuyuya hareket ettirin.
5. İmmünofloresan Görüntüleme
- Bölümleri ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu veya konfokal mikroskop altında görüntüleyin (20X, 40x veya daha yüksek büyütme, en iyi sonuçlar için bir Z-yığını planında 2 μm'lik artışlarla ardışık çerçeveler kullanın).
- Mikroskop bağlantılı bir kamera ile görüntü elde edin
- Pozitif sinyalleri, sinyalin uzamsal dağılımı ve yoğunluğu açısından bölümlerde analiz etmek için yeterli bir görüntüleme yazılımı (yani ImageJ) kullanın. Bunu yapmak için aşağıda belirtilen adımları gerçekleştirin.
- Dosyayı ImageJ yazılımıyla açın.
- Her bir renk kanalını analiz etmek için Görüntü > renk > bölünmüş kanallara tıklayın.
- Birden çok bölüm alımının birleştirilmesini elde etmek için Z projesi > > yığını görseli'ne tıklayın.
- Aynı alımın farklı renk kanallarının birleşimini elde etmek için Görüntü > renk > Kanalları birleştir'i tıklatın.
Tablo 1: Gerekli çözümler. Protokol için gerekli çözümlerin listesi ve nasıl hazırlanacağına dair kısa açıklama.
Antifriz çözeltisi
(4 °C'de 6 aya kadar saklayın) | % 30 Gliserol
% 30 Etilen glikol
% 30 dH2O
%10 2x Fosfat tamponu |
Engelleme çözümü
(şu anda hazırlanın) | %4 Normal Keçi Serumu
% 1 Triton X-100
in Yıkama çözeltisi |
Kriyo-koruyucu
(4 °C'de 6 aya kadar saklayın) | % 20 Gliserol
%80 Sorensen'in çözümü |
Disodyum hidrojen fosfat çözeltisi
(6 aya kadar RT'de saklayın) | 0.45M Disodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4) dH2O
Steril bir şişede süzün |
Lizin çözeltisi
(4 °C'de 3 haftaya kadar saklayın) | 0.3M L-Lizin monohidroklorür çözeltisinin% 50'si
0.1M Sorensen çözeltisinin% 50'si pH 7.6
pH 7.4, steril bir şişede filtre |
Paraformaldehit (PFA) %8
(çeker ocak altında hazırlayın ve 4 °C'de 1 aya kadar saklayın) | dH2O'da 2,6 M PFA (formik asit oluşumunu önlemek için 55 ° C'ye kadar C_do 60 ° C'yi aşmayın)
steril bir şişede filtre |
Fosfat tamponu 2x
(4 °C'de 6 aya kadar saklayın) | % 6 Monosodyum fosfat (NaH2PO4) çözeltisi
dH2O içinde% 45 Disodyum fosfat (Na2HPO4) çözeltisi |
PLP fiksatif solüsyon
(şu anda hazırlanın, çeker ocak altında) | %25 Paraformaldehit %8
0.01M Sodyum (meta)periodontat
% 75 Lizin çözeltisi |
Sodyum Dihidrojen Fosfat Monohidrat
(6 aya kadar RT'de saklayın) | 0.52M Sodyum Dihidrojen Fosfat Monohidrat (NaH2PO4 * H2O) dH2O < br / >
Steril bir şişede süzün. |
Sorensen'in çözümü
(4 °C'de 1 aya kadar saklayın) | % 2.5 Monosodyum fosfat çözeltisi
% 18.7 Disodyum fosfat çözeltisi
pH 7.6, dH2O cinsinden |
Yıkama solüsyonu
(şu anda hazırlanın) | 0.25M Trizma tabanı
0,26 milyon NaCl
pH 7.6, dH2O cinsinden |
Çalışma çözümü
(şu anda hazırlanın) | %50 Engelleme çözümü
% 50 Yıkama çözeltisi |
