Murin bağırsak iltihabını değerlendirmek için floresan aracılı tomografi kullanma

Özet

Kaynak: Nowacki, T. M., et al. Makrofajla İlişkili Murin Bağırsak İltihabının Tespiti ve Miktarının Belirlenmesi için Floresan Aracılı Tomografi. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu videoda, floresan aracılı tomografi (FMT) kullanılarak bir fare kolit modelinde bağırsak makrofaj infiltrasyonunu değerlendirmek için bir teknik gösterilmektedir. Dekstran sodyum sülfat (DSS) yoluyla bir farede kolit indüklendikten sonra, hayvana kolondaki sızmış makrofajlar üzerindeki F4 / 80 glikoprotein markörünü tanıyan antikorlar enjekte edilir. Fare daha sonra floresan ve yansıma sinyallerinin floresanın uzamsal dağılımını ve yoğunluğunu belirlemek için üç boyutlu bir görüntüye yeniden yapılandırıldığı bir FMT cihazında görüntülenir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Malzemeler ve Deney Düzeneği

1. Hayvan bakımı.
   1. DSS'ye duyarlı herhangi bir suşun (ör., C57BL / 6) 20-25 g vücut ağırlığında.
   2. Deney grubu başına en az beş veya daha fazla fare planlayın ve fareleri yerel hayvan bakım yönergelerine göre barındırın.
   3. Standart bir kemirgen yemeği diyeti ve otoklavlanmış içme suyu ad libitum sağlayın.
   4. Endolüminal otomatik floresansı azaltmak için taramadan en az üç gün önce standart yemi çıkarın ve yonca içermeyen yemle değiştirin.
2. Akut DSS'nin neden olduğu kolitin indüksiyonu.
   1. % 2 (a / v çözelti) elde etmek için 2 g DSS'yi (moleküler ağırlık ~ 40.000 Da) 100 mL otoklavlanmış içme suyunda çözün.
   2. Farelerin içme kaynağını yalnızca DSS solüsyonu ile doldurun ve fare başına günde 5 mL sıvı tahmin edin. Kontrol farelerine DSS olmadan aynı içme suyunu sağlayın.
      not: Deneyin sonuna kadar fareleri günlük olarak izleyin. Başlangıçtaki vücut ağırlığının% 20'sinden fazlasını kaybeden veya can çekişen farelere ötenazi yapın (yani, sürekli kambur duruş, azalmış hareket, zor nefes alma, belirgin şekilde dik tüyler) hayvan refahı ile ilgili yerel geçerli yönergelere göre.
3. Floresan aracılı tomografi hazırlanması.
   1. İstenen antikoru (örneğin, sıçan anti-fare F4/80) floresan boya ile (örneğin, Siyanin7, λ_uyarma: 750 nm, λ_emisyon: 776 nm) üreticinin protokolünde açıklandığı gibi etiketleyin. Saflaştırılmış antikoru uygun bir diyaliz membranında (gözenek boyutu 50-100 kDa) 1 L 0.15 M sodyum klorüre karşı en az 2 saat veya gece boyunca diyaliz <.
      1. Antikoru 1 L 0.1 M NaHCO3'e aktarın ve en az 2 saat diyalize edin.
      2. Gerekli miktarda floresan boyayı dimetil sülfoksit (DMSO) (10.8 μL/mg antikor) içinde çözün ve antikor çözeltisine ekleyin. 1:3'lük bir boya-protein oranı elde etmek için floresan boyayı 20 kat azı dişi fazlalıkta kullanın.
      3. Karanlıkta 4 ° C'de 1 saat inkübe edin. 1 L 0.15 M sodyuma karşı diyaliz yoluyla veya bir PD-10 tuz giderme kolonu kullanarak etiketlenmemiş antikorları çıkarın ve in vivo uygulama için fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözün.
      4. Spektrofotometri ile nihai antikor konsantrasyonunu ve etiketleme oranını belirleyin.
      5. Protein konsantrasyonunu 250-330 nm'lik bir emilimde ölçün ve boya tarafından ek emilimi göz önünde bulundurun. Siyanin etiketlemesi için 280 nm'de (protein) maksimum absorpsiyonu, 750 nm'de (sonraki adım) maksimum emilimin %11'i kadar düzeltin.
      6. Bileşiğin seyreltilmesini (tipik olarak 1:10) 250-800 nm'de ölçün ve Siyanin7 konsantrasyonunu 750 nm'de çıkarın.
      7. Boya-protein oranını şu şekilde belirleyin: boya / antikor = 750 nm / 200.000'de maksimum absorpsiyon / (280 nm'de maksimum absorpsiyon - 750 nm'de 0.11 x maksimum absorpsiyon) / 170.000.
      8. Antikor solüsyonunu 4 °C'de tutun ve enjeksiyondan önce ağartmayı önlemek için ışıktan koruyun.
   2. Gerekli antikor çözeltisi hacmini enjeksiyondan hemen önce steril bir şırıngaya yükleyin ve kullanılana kadar ışıktan koruyun.
   3. İzleyici farmakokinetiğine bağlı olarak prob enjeksiyonunun ve tarama prosedürünün en uygun zamanlamasını belirleyin.
   4. Oksijende% 1.5 - 2.5 inhale izofluran kullanarak fareleri uyuşturun veya etiketli antikorların kuyruk veni enjeksiyonu için özel bir tutucuya güvenli bir şekilde yerleştirin.
   5. Tam uzunlukta antikorlar için, murin kolitinde anti-fare F4 / 80 makrofaj görselleştirmesi gibi taramadan en az 24 saat önce etiketli antikoru enjekte edin. Fareleri 2.0 nmol boyaya karşılık gelen bir miktarda etiketli antikor ile kuyruk damarı yoluyla intravenöz olarak (i.v.) enjekte edin.
   6. Eşit olarak etiketlenmiş spesifik olmayan antikorları kullanın (ör., sıçan IgG veya birincil antikor mirasına karşılık gelen başka bir izotip), spesifik probunkine eşdeğer dozlarda bir izotip kontrolü olarak.
      not: Kontrol bileşiğinin enjeksiyonundan sonra in vivo taramaların sonuçları, spesifik prob görüntüleme verilerinin yorumlanması için bir referans görevi görebilir.
   7. Işık yansımasını ve emilimini en aza indirmek için karın bölgesindeki hayvan kürkünü tıraş etmek için elektrikli bir tıraş bıçağı kullanın.

2. Teknik Ekipman

1. Küçük hayvan floresansı için veteriner floresan aracılı tomografi (FMT) cihazı kullanın (Şekil 1).
2. "Yeni çalışma" düğmesine tıklayarak her proje için yeni bir çalışma oluşturun ve ileride başvurmak üzere görüntüleme parametreleri ve dozları da dahil olmak üzere ilgili izleyicileri çalışma açıklamasına ekleyin.
3. Bu çalışma kapsamında, "yeni çalışma grubu" düğmesine tıklayarak ilgili çalışma tasarımına göre (örneğin, spesifik izleyici ve spesifik olmayan izotip kontrolü için) çalışma grupları oluşturun. Her çalışma grubunu ilgili sayıda hayvanla donatın.
4. İzleyici yapıları için sistemi kalibre edin.
   1. Etiketlemedeki varyasyonu normalleştirmek ve OI verilerinden kantitatif ölçümü etkinleştirmek için her bir izleyici grubu için kalibrasyonu gerçekleştirin.
   2. Her bir sistemin kalibrasyonu için cihaz üreticisinin kılavuzunu takip edin; "Yeni izleyici ekle" seçildikten sonra, sistem adımlar boyunca bir kılavuz sağlayacaktır. Uygulanan antikor çözeltisinin seyreltilmesini ve probdaki izleyicinin hesaplanan mutlak konsantrasyonunu sağlayın.
   3. FMT için, tanımlanmış kalınlık ve absorpsiyon özelliklerine sahip (hayati dokuya benzeyen) dokuyu taklit eden bir fantom kullanın ve kullanılan antikor çözeltisinin belirli bir hacmi ile doldurun. Bunu FMT cihazında ölçün.
      not: Sistem, gelecekteki in vivo ölçümlerden mutlak izleyici konsantrasyonlarını hesaplamak için verilen konsantrasyonla birlikte sağlanan probun referans ölçümünü kullanacaktır.
5. 42 °C.
   sıcaklıkta ısıtılabilir bir muayene kaseti kullanın not: Bu, farelerin muayene sırasında hipotermik hale gelmesini önler.

3. Hayvan Anestezisi

1. Fareleri uyuşturmak için sürekli %1.5 - 2 hacimce izofluran ([2-kloro-2- (diflorometoksi)-1,1,1-trifloro-etan]) ve 1.5 L O₂ / dak akış kullanın. Anestezik derinliğini kolayca kontrol etmek ve personel maruziyetini en aza indirmek için kemirgen anestezisi (izofluran buharlaştırıcı) için özel olarak tasarlanmış inhalasyon sistemleri kullanın.
2. Fareyi sızdırmaz indüksiyon odasına yerleştirin ve izofluran beslemesi için buharlaştırıcıyı açın (%100 (h/v), oksijende %5 hacim, 3 L/dk). Fareyi yaslanmış ve bilinçsiz olana kadar izleyin.
3. Muayene sırasında hareket artefaktlarını en aza indirmek için %100 v/v, %1.5 hacimce oksijen, 1.5 L/dk dozunda burun konisi yoluyla sürekli izofluran inhalasyonu ile tomografi için muayene kasetine yerleştirin. 5 dakikadan uzun süren prosedürlerde, kornea hasarını önlemek için fare gözlerine göz merhemi sürün.
4. Refleksleri kontrol ederek anestezik derinliği değerlendirin. Fareyi sırt üstü yatırın; Anestezi yeterli ise, fare dönmemelidir. Fareyi ayak parmaklarının arasında yumuşak bir şekilde sıkıştırın; Anestezi yeterli ise bacak çekilmez (cerrahi tolerans aşaması).

4. Floresan Aracılı Tomografi Taraması

>NOT: Bu çalışmada kullanılan FMT sistemine özgü aşağıdaki detayları (Malzeme Tablosuna bakınız) alternatif floresan yansıma görüntüleme cihazları veya FMT sistemleri için gerektiği gibi uyarlayın.

1. Anestezi uygulanmış fareyi muayene kasetine sırt üstü yatırın.
2. Tarama prosedürünü gerçekleştirin.
   1. Kaseti görüntüleme sistemine yerleştirin ve sürekli anestezi sağlamak için hemen kapatın. Daha önce oluşturulan çalışma grubundan uygun örneği seçin. İzleyici konsantrasyonu değerlerinin doğru bir şekilde hesaplandığından emin olmak için açılır menüden uygulanan izleyiciyi seçin.
   2. Tarama planlaması için uygun dalga boyunda (Siyanin için 720 nm) floresan yansıtma görüntüsü elde edin ve "görüntü al" düğmesine tıklayarak tarama alanını ana hatlarıyla belirtin.
   3. Tarama alanının, floresan yansıma görüntüsünde bir kaplama olarak göründüğüne bakın. Havadan veya kalan kürk alanlarından kaçınarak ilgilenilen bölgeye (örneğin kolon veya karın) göre ayarlayın. Görüntü hedefine bağlı olarak, sağdaki menüde kabadan ortaya ve ince tarama alanı çözünürlüğü arasından seçim yaparak tarama alanındaki görüntü veri noktalarının sayısını ayarlayın.
      not: İnce bir tarama alanının, önemli ölçüde daha uzun bir tarama süresi pahasına daha iyi uzamsal çözünürlük sunabileceğini unutmayın.
   4. "Tara"ya tıklayarak seçilen dalga boyunda veri/görüntü alımını başlatın.
      not: Tüm karnın orta-ince taraması için tarama süresi yaklaşık 5 dakika olacaktır; Bu sürede, her bir veri noktası uyarma lazeri tarafından ayrı ayrı aydınlatılır ve elde edilen floresan kaydedilir.
   5. Taramanın sonunda hayvanı görüntüleme kasetinden çıkarın ve hayvanı kafese geri koymadan önce tamamen iyileşmesini bekleyin.
   6. Deney sırasında çeşitli zaman noktalarında gerekli görülürse FMT'yi tekrarlayın (örneğin, 0, 5 ve 9 - 10. günler (deneyin sonu)), ancak vücutta antikor birikimini göz önünde bulundurun, bu nedenle arka plan floresan sinyalini artırın.

5. Verilerin Yeniden Yapılandırılması ve Yorumlanması

1. Ham görüntüleme verilerinden floresan dağılımının 3D haritalarını oluşturmak için ilgili görüntüleme yazılımının rekonstrüksiyon aracını kullanın; tarama sırasında "rekonstrüksiyon kuyruğuna ekle" fonksiyonu seçildiğinde, taramalar otomatik olarak rekonstrüksiyon aracına eklenir.
   1. Aksi takdirde, ilgili çalışma ve çalışma grubunun altındaki açılır menüden taramaları seçin, taramaya sağ tıklayın ve "rekonstrüksiyona ekle"yi seçin.
2. Daha fazla analiz için, analiz yazılımına bir veri seti yükleyin. Üst çubuktaki açılır menüden ilgili çalışmayı seçin ve ardından sağdaki menüden çalışma grubunu ve tek tek hayvanı seçin; Bu hayvan için yapılan tüm taramalar gösterilecektir. Doğru taramayı seçin ve "yükle"ye tıklayın.
   not: İzleyici dağılımının 3D rekonstrüksiyonu, başlangıçta elde edilen floresan yansıtma görüntüsünün bir kaplaması olarak solda görünecektir. Model, daha kolay analiz için döndürülebilir ve büyütülebilir.
3. Yeniden yapılandırılmış 3B haritalarda spesifik olmayan etiket birikiminin odaklarını (örneğin, karaciğer veya idrar kesesi) tanımlayın ve hedef dokulardan (örneğin, bağırsak veya bağırsak) ayırt edin.
4. Üst çubuktan, hedef için en uygun ROI şeklini seçin. İlgili ölçüm araçlarını analiz yazılımına yerleştirerek hedef dokuyu ilgi alanları (ROI) olarak etiketleyin; yazılım, ROI için bir floresan yoğunluğunun yanı sıra taramanın kalibre edildiği izleyicinin (piko-) molar miktarlarını sağlayacaktır.
5. Enflamatuar infiltrat (histoloji) ile ilişkili olarak hastalık aktivitesinin değerlendirilmesi için en uygun eşdeğer olarak, ROI boyutu için normalize edilmiş uygun ROI'deki toplam izleyici miktarını seçin.
   not: ROI'nin diğer özellikleri, uygunsa belirli bir modeli temsil edecek şekilde seçilebilir.

Sonuçlar

Şekil 1. Murin kolitinde makrofaj infiltrasyonlarının tomografik görüntülenmesi.

FMT, kolitik farelerde ve murin F4/80'e karşı Cyanine7-konjuge antikor uygulanan kolitik olmayan kontrollerde tarar (grup başına n = 5). (A) Çubuk grafik: boyanın pmol'ündeki toplam floresan yoğunluğu ROI'de belirlendi ve SEM ± gösterildi. Temsili görüntüler, spesif...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif
Yonca içermeyen diyet	Harlan Laboratuvarları, Madison, ABD	2014
Bepanthen göz merhemi	Bayer, Leverkusen, Almanya	80469764
Dekstran sülfat sodyum (DSS)	TdB Konsolosluğu, Uppsala, İsveç	DB001
Eozin	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Almanya	E 4382
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Almanya	E 9884
Florene 100V/V	Abbott, Wiesbaden, Almanya	B506
Hematoksilen	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Almanya	HHS32-1L
O.C.T. Doku Tek bileşiği	Sakura, Zoeterwonde, Hollanda	4583	histolojik analizler için fiksatif
Fosfat tamponlu tuzlu su, PBS	Lonza, Verviers, Belçika	4629
Sodyum Klorür %0,9	Braun, Melsungen, Almanya	5/12211095/0411
Sodyum bikarbonat tozu	Sigma Aldrich Deisenhofen, Almanya	S5761 Serisi
Standart diyet	Altromin, Lage, Almanya	1320
Doku-Tek Kriyokalıp	Sakura, Leiden, Hollanda	4566
Hemokült (guaiac kağıt testi)	Beckmann Coulter, Almanya	3060
Biotin sıçan-anti-fare anti-F4 / 80 antikoru	Serotec, Oxford, Birleşik Krallık	MCA497B
Biotin sıçan-anti-fare anti-GR-1	BD Pharmingen, Heidelberg Almanya	553125
Streptavidin-Alexa546	Moleküler Problar, Darmstadt, Almanya	S-11225 Serisi	Uyarma / Emisyon Maksimum: 556 / 573nm
Anti-CD11b sıçan-anti-fare antikoru TC	Calteg, Burlingame, Amerika Birleşik Devletleri	R2b06
Saflaştırılmış anti-fare F4/80 antikoru	BioLegend, Londra, Birleşik Krallık	123102
DAPI (DAPI	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Almanya	D9542
FITC konjuge anti-Ly6C sıçan-anti-fare antikoru	BD Pharmingen, Heidelberg, Almanya	553104
FACS arabelleği	BD Pharmingen, Heidelberg, Almanya	342003
Cy7 NHS Ester	GE Sağlık Avrupa, Freiburg, Almanya	PA17104
MPO ELISA	Immundiagnostik AG, Bensheim, Almanya	K 6631B
Cy5.5 işaretli anti-fare F4/80 antikoru	BioLegend, Londra, Birleşik Krallık	123127	kullanıma hazır etiketli Antikorlar (alternatif)
Anti-Fare F4/80 Antijen PerCP-Siyanin5.5	eBioscience, Waltham, Amerika Birleşik Devletleri	45-4801-80	kullanıma hazır etiketli Antikorlar (alternatif)
DMSO (Dimetil sülfoksit)	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Almanya	67-68-5
İzofluran	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Almanya	792632
etanol	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Almanya	64-17-5
Sığır Serum Albüminleri (BSA)	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Almanya	A4612
Tris Tamponlu Tuzlu Su Çözeltisi (TBS)	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Almanya	SRE0032
ekipman
FACS Calibur Akış Sitometri Sistemi	BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Almanya
FMT 2000 In Vivo Görüntüleme Sistemi	PerkinElmer Inc., Waltham, MA, Amerika Birleşik Devletleri	FMT2000
True Quant 3.1 Görüntüleme Analiz Yazılımı	PerkinElmer Inc., Waltham, MA, Amerika Birleşik Devletleri	FMT2000 dahil
Leica DMLB Floresan Mikroskobu	Leica, 35578 Wetzlar, Almanya	DMLB (İngilizce
Bandelin Sonopuls HD 2070	Bandelin, 12207 Berlin, Almanya	HD 2070	ultrasonik homojenizatör
Tek kullanımlık neşter No 10	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Almanya	Z692395-10 adet
Metzenbaum makas 14cm	Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Almanya	22398330
Luer kilit şırınga 5ml	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Almanya	Z248010
şırınga iğneleri	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Almanya	Z192368
Şahin Tüpü 50ml	BD Biosciences, Erembodegem, Belçika	352070

Yılı Serisi Serisi Serisi adet Serisi ) Serisi Serisi olanlar ) Serisi