Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Özel Dizi Düzeni Tasarımı ve Üretimi
- Karşılık gelen alel çağrılarına sahip bir peptit dizileri elektronik tablosu oluşturun. Dizinin 20 satırı ve 30 sütunu vardır ve peptitler için 20x30=600'e kadar nokta tutabilir. Belirli bir donörden adım 1.5'te kaydedilen toplam peptit sayısına bağlı olarak ve denediğimiz iki örnekle ilgili geçmiş deneyimlerimize dayanarak, 600 spot dizisi ~ 2 ayrı nakil vakasından üretilen tüm dizileri tutabilir.
- Peptit kümelerini dizinin 600 spot formatına sığdırmanın en verimli yolunu rasyonel olarak planlayın.
- Bir tam diziye birden fazla konu sığabiliyorsa, 30'a bölünebilecek toplam satır sayısıyla (dizideki bir satırdaki nokta sayısı) eşleşmesi için ilk bağışçının dizilerinden sonra boş satırlar ekleyin.
- İlk dizi seti için son boş satırın hemen ardından, ikinci nakil durumundaki dizi içeriğinin tüm sütununu yapıştırın.
- Dizi dolana ve 600 noktayı aşmadan daha fazla vaka eklenemeyene kadar bu adımları tekrarlayın. Boş satırların tamamı altta doldurulmaya bırakılmışsa, boş satırı iki donör seti arasına yerleştirilecek şekilde "hareket ettirin". Kasalar arasında kalan bu geniş boşluk, sentezin tamamlanmasından sonra zarın kesilmesini kolaylaştırır - adım 2.2'yi izleyerek. aşağıda.
- Peptit dizilerini dizi düzeni bağlamında programlayın. SPOT sentezleyicinin programı, dizilerin bir metin formatını (bir satır, bir peptit dizisi) alır, bu da adım 1.1.4'ten elde edilen elektronik tabloyu basit bir metin belgesi olarak kaydederek doğrudan elde edilebilir (alel adları, aa pozisyonları vb. için ekstra sütun(lar) olmadan).
- SPOT sentezleyici aracılığıyla otomatik peptit dizisi sentezini çalıştırın. Sentezin tüm işlemi Kudithipudi ve ark. İki dizinin Fmoc sentezinin ~ 4-5 gün sürdüğünü unutmayın.
2. Bireysel Bir Nakil Alıcısının Zaman Serisinden Antiserumları İnceleyin ve Yeniden Araştırın.
NOT: 600 noktalı membran dizisi ~7 cm x 13 cm boyutlarındadır. Sentezden sonra, diziler doğrudan ışıktan korunduğunda en az iki yıl boyunca kuru zarlar olarak oda sıcaklığında saklanabilir. Tekrarlanan kullanım için uzun ömürlülüğünü korumak için zarın aşırı katlanmasından kaçının.
- Membran dizisini etanol ile yeniden sulandırın ve Ponceau S ile lekelenmiş peptit lekelerini görselleştirin.
- Li ve ark. tarafından optimize edilmiş aşamalı bir prosedürü izleyerek peptitleri taşıyan zar dizisini yeniden sulandırın.
- Dizi zarını 20 mL %100 etanole daldırın.
- Çözeltiyi% 50 etanole seyreltmek için 20 mL damıtılmış su ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
- Daldırma solüsyonunu üç kez 40 mL %100 suya değiştirin ve her seferinde 15 dakika inkübe edin.
- Uygun bir çalışma tamponunda, örneğin 20 mL TBST'de (% 0.1 ile Tris tamponlu tuzlu su), her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- Sentetik peptitleri görselleştirmek için dizinin Ponceau S boyaması
- 20 mL önceden formüle edilmiş Ponceau S solüsyonunu doğrudan hidratlı diziye ekleyin ve çalkalayarak ~ 30 s inkübe edin.
- Arka plan Ponceau S renginin lekesini çıkarmak için damıtılmış suyu zarın üzerinden sürekli olarak akıtın. İşlem sırasında, kırmızı renkli peptit lekeleri görünür hale gelebilir.
- Bireysel durumlar için dizinin bölümleri arasında dikkatli bir şekilde keserek her bir verici için dizinin bölümlerini ayırın. Her dizinin yönünü işaretleyin.
- Ön blok dizisi.
- Membranı, TBST tamponunda çözülmüş 20 mL% 5 yağsız sütte bloke edin. Bu süt bazlı çözüm, Ponceau S renginin lekesini daha da çıkaracaktır. En net peptit görüntülerini elde etmek için süt tamponunu birkaç kez değiştirin.
- Kayıt tutma amacıyla, bir el kamerası kullanarak dizinin Ponceau S görüntüsünün fotoğrafını çekin (Şekil 1'deki örnek).
- %5 yağsız sütte membranı 4 °C'de gece boyunca veya oda sıcaklığında 2 saat sallayarak bloke etmeye devam edin.
- Diziyi nakil antiserumu ile inkübe edin.
not: Prozon veya Hook etkisi olarak bilinen bir fenomenin, serum antikor analizinde komplemana bağlı girişimden kaynaklanabileceğine dikkat edilmelidir. Bu sorunu aşmak için, etilendiamintetraasetik asit (EDTA) veya serum örneklerinin ısıyla inaktivasyonu ile isteğe bağlı bir serum ön işlem adımı düşünülebilir.
- Bloke edici tamponu çıkarın ve membranı ertesi gün üç kez 20 mL TBST ile her seferinde 5 dakika boyunca yıkayın.
- TBST tamponunda 20 mL% 2.5 süte alıcının ham serumundan 20 μL ekleyin ve oda sıcaklığında 2-3 saat membran ile inkübe edin. Bu ilk sondalama turunda, zaman serisindeki son nakil sonrası serumun (veya muhtemelen en hassaslaştırılmış serumun) ilk olarak kullanılması önerilir. Bu, serideki daha önceki örneklerin, özellikle nakil öncesi zaman noktalarından, zamanla gelişme eğiliminde olan daha az alloantikor çeşitliliğine sahip olduğu varsayımına dayanmaktadır. Bu şekilde, sondalama turları arasındaki "taşımadan" kaynaklanan herhangi bir sinyal girişimi olasılığı, grefte karşı bağışıklık tepkileri nedeniyle gerçekten gelişmiş alloantikor reaktivitesinden açıkça ayırt edilebilir.
- Diziyi 20 mL TBST kullanarak yıkayın ve ikincil bir antikor ile inkübe edin.
- Membranı her seferinde 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- Keçi anti-insan IgG-HRP (Yaban turpu peroksidaz) ikincil antikoru ile TBST tamponunda 1: 10.000 seyreltmede inkübe edin, 2 saat daha% 1 süt ile desteklenmiştir.
- Lekeyi yıkayın ve geliştirin.
- Membranı her seferinde 10 dakika boyunca TBST ile üç kez yıkayın.
- Membranı geliştirmek için (1 dakika boyunca) 5 mL peroksit çözeltisi ile taze karıştırılmış 5 mL luminol çözeltisi kullanarak gelişmiş kemilüminesans (ECL) gerçekleştirin.
- Uygun bir görüntüleyici (ör. ChemiDoc Görüntüleme Sistemleri veya Azure C600) kullanarak ECL sinyallerini görselleştirin.
- Lekeyi tarayın ve nicelleştirin.
- Geliştirilen görüntüleri kaydedin (Şekil 2, alttaki resim) ve nokta yoğunluğunun ölçülmesini gerçekleştirin.
>3. Klinik Zaman Serisinde Antiserum Reaktivitesini Karşılaştırın.
- Diziyi soyun.
- Bu noktada, zarı her zaman ıslak tutun.
- 20 mL ticari sıyırma tamponu ile 37 ° C'de 20 dakika inkübe ederek membranı soyun ve ardından membranı TBST ile her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. Daha sonra bloke etme (adım 3.2) ve sondalama (adım 3.3) adımlarını, hastanın farklı bir zaman noktasında alınan farklı bir serumunu kullanarak tekrarlayın.
- Soyulmuş zarı engelleyin.
Not: Sıyırma işleminden sonra, membran bir zaman serisinde aynı hastadan farklı bir serumun başka bir sondalama turu için yeniden kullanılabilir.
- Daha önce olduğu gibi %5'lik süt tamponu kullanarak membranı bloke edin (bkz. adım 2.2).
- Aynı zaman serisinden farklı bir antiserumu yeniden problayın (2.3-2.6'dan adımları tekrarlayın; örnek Şekil 2'de, üstteki resim).
not: Soyulmuş dizi daha sonra başka bir serum örneğini yeniden araştırmak için kullanılabilir. Peptitler, zarın destekleyici matrisine kovalent olarak konjuge olduğundan, dizinin performansını kaybetmeden 20 tura kadar sıyırma ve yeniden problama döngüsü için yeniden kullanılabileceğini gösterdik.
