Basılı Glikan Dizisi ile Dolaşımdaki Anti-Glikan Antikorlarının Saptanması

Özet

Kaynak: Olivera-Ardid, S. ve diğerleri, Basılı Glikan Dizisi: Küçük Hayvanlarda Dolaşımdaki Anti-karbonhidrat Antikorlarının Repertuarının Analizi için Hassas Bir Teknik.J. Vis. Uzm.(2019)

Bu video, fare serumunda dolaşımdaki anti-glikan antikorlarını analiz etmek için basılı glikan dizisi teknolojisini göstermektedir. Serumdaki antikorlar, çip üzerindeki spesifik glikanlarla etkileşime girer ve bu, immün boyama ve ardından floresan taraması ile doğrulanır.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Glikoçip Üretimi

1. Mikrodizi hazırlama
   1. Glikanları (50 mM) ve polisakkaritleri (10 μg/mL) 300 mM fosfat tamponlu salin (PBS, pH 8.5) içinde 6 kopyada N-hidroksisüksinamid türevli cam slaytlar üzerine temassız robotik arrayer (damla hacmi ~ 900 pL) kullanarak yazdırın. Her slayt, 6 kez tekrarlanan 4 farklı alt dizi bloğu (Şekil 1A, renkli) içerir. Her bir alt dizi, kontroller (8 satır × 14 sütun) dahil olmak üzere 112 farklı glikan noktasından oluşur (Şekil 1B).
      not: Glikan ile ilgili bilgiler Tablo 1'de verilmiştir. Mikroçipleri basmak için kullanılan glikan kütüphanesi, IBCh ekibinin uzun vadeli sentetik bir çabasının sonucudur; Sentez örnekleri ilgili yayınlarda açıklanmıştır. Glikan kütüphanesi, kan grubu antijenleri ve en sık görülen terminal oligosakkaritlerin yanı sıra memeli N ve O'ya bağlı glikoproteinlerin ve glikolipidlerin, tümörle ilişkili karbonhidrat antijenlerinin ve patojenik bakterilerden elde edilen polisakkaritlerin çekirdek motiflerini içeriyordu.
   2. Slaytları bir nem kutusunda (bağıl nem ~% 70) oda sıcaklığında (25 ° C) 1 saat inkübe edin.
   3. Mikrodizilerin bloke edilmesi: slaytları oda sıcaklığında bloke edici tampon ile 1,5 saat inkübe edin (100 mM borik asit, 25 mM etanolamin, ultra saf suda %0,2 (h/h) Tween-20).
   4. Glikobiti ultra saf suyla yıkayın ve hava ile kurulayın.
2. Glikoçip kalite kontrolü
   1. 1 mg / mL kompleks immünoglobulin preparatı çözeltisi (immünoglobulin içeren CIP: IgG, IgM ve IgA), ikincil bir antikor olarak 10 μg / mL biyotinile keçi anti-insan immünoglobulin çözeltisi (IgM + IgG + IgA), ardından karşılık gelen floresan streptavidin konjugatının 1 μg / mL çözeltisi (aşağıda açıklanan protokol aracılığıyla, bkz. adım 2).
   2. Glikoçipleri tarayın ve analiz edin (bkz. adım 3, glikan dizisinin analizi).
   3. Çip içi ve çipler arası korelasyonu 0,9'dan yüksek olan mikrodizi grupları kullanın.

2. Glikan Dizi Tekniği

1. Aşağıdaki sulu çözeltileri (ultra saf suda) hazırlayın ve oda sıcaklığında (25 °C) saklayın:
   1. Tampon-1: Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde %1 (a/h) sığır serum albümini (BSA), %1 (h/h) Tween-20 ve %0.01 (a/h) sodyum azid (_NaN3).
   2. Tampon-2: PBS'de %1 (a/h) BSA, %0,1 (h/h) Ara-20 ve %0,01 (a/h) NaN₃.
   3. Tampon-3: PBS'de %0.1 (h/h) Ara-20.
   4. Tampon-4: PBS'de %0.001 (h/h) Ara-20.
2. Glikoçip ve numune hazırlama
   1. Slaytlarla birlikte saklama kutusunu oda sıcaklığına (25 °C) ulaşana kadar masanın üzerine koyun.
      not: Pudrasız lateks eldiven kullanın. Glikoçip, barkodun bulunduğu cam sürgünün alt kısmı tarafından manipüle edilmelidir. Barkod, glikanların basıldığı yüzeyle temasını önleyerek sağ tarafı tanımlamanıza yardımcı olacaktır.
   2. Kutuyu açın, glikoçipi alın ve hazne içindeki nemi sabit tutmak için ıslak filtre kağıdı ile şartlandırılmış inkübasyon odasına (25 °C) yerleştirin.
   3. Bu arada, fare serumunu 1.5 mL'lik tüplerde Buffer-1 (1:20) ile seyreltin. Serum çözeltisini (5 s) bir vorteks karıştırıcı ile homojenize edin.
      not: Tek bir glikofit yüzeyini tamamen kaplamak için gereken hacim yaklaşık 1 mL'dir.
   4. Homojenizasyondan sonra, immünoglobulin agregasyonunu önlemek için seyreltilmiş serumu 37 ° C'de 10 dakika boyunca bir su banyosunda inkübe edin. Tüpleri 10.000 x g ve 25 ° C'de 3 dakika santrifüjleyin, süpernatanı toplayın ve çökelen malzemeleri atın.
   5. Glikoçipi dikkatlice inkübasyon odasına yerleştirin. Glikoçipin yüzeyindeki kalıntı materyali ortadan kaldırmak için 1 mL Tampon-3 ile 25 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
   6. Glikoçipi dikey konumda tutun ve plastik bir Pasteur pipeti kullanarak birkaç damla Buffer-3 ile tekrar yıkayın. Filtre kağıdı kullanarak tamponu glikoçip yüzeyinden dikkatlice çıkarın.

3. Reaksiyon: antikorların bağlanması

1. Glikoçipi inkübasyon odasına yerleştirin. Seyreltilmiş serum örneğini bir mikropipet kullanarak glikokip yüzeyine yayın. 37 ° C'de 1,5 saat orbital çalkalama (30 rpm) ile inkübe edin. Glikofit yüzeyinin tüm kuru alanının, pipetin ucunu kullanarak seyreltilmiş serum numunesi ile kaplandığından emin olun.
2. Fazla numuneyi çıkarın ve glikobiti 5 dakika boyunca 25 ° C'de Tampon-3'e daldırın. Ardından, glikoçipi Buffer-4 (5 dakika) içeren bir kaba alın ve son olarak glikozi, ultra saf suyla yıkayın (5 dakika). Sıvıyı çıkarmak için glikoçipi 175 x g ve 25 °C'de 1 dakika santrifüjleyin.

4. Tespit: ikincil antikor

1. Glikoçipi inkübasyon odasına yerleştirin. Glikoçip yüzeyine Tampon-2'de biyotin ile konjuge edilmiş bir keçi anti-fare (IgG + IgM) çözeltisi (5 μg/mL) yayın. 37 ° C'de 1 saat boyunca orbital çalkalama (30 rpm) ile inkübe edin.
2. Bağlanmamış fraksiyonu çıkarın ve yıkama adımlarını tekrarlayın.
3. Santrifüjlemeden sonra, glikobiti karanlıkta 25 °C'de 45 dakika (30 rpm) 2 μg/mL karşılık gelen florokrom etiketli streptavidin çözeltisi (Tampon-2'de) ile inkübe edin.
4. Karanlıkta, bağlanmamış fraksiyonu çıkarın ve yıkama adımlarını tekrarlayın.
5. Glikokiti hava ile kurutun.
   not: Glikoçip mümkün olan en kısa sürede taranmalıdır. Ancak boyamadan hemen sonra tarama yapmak mümkün değilse, glikoçipler karanlıkta serin ve kuru bir yerde saklanabilir.

3. Glikan Dizisinin Analizi

1. Diziyi tarayın
   1. Glikoçipi karanlıkta oda sıcaklığına ulaşana kadar masanın üzerinde bırakın. Aynı zamanda, slayt tarayıcıyı ve lazeri açın (633 nm uyarma dalga boyu).
   2. Mikrodiziyi tutarak, glikoçipi arkaya değene kadar yuvaya kaydırın.
   3. Glikoçipi tarayın ("kolay taramayı çalıştır") ve taramayı bir " olarak kaydedin. TIFF" dosyası.

Tablo 1: Glikanların listesi, bunların BALB/c farelerinin (n = 20) doğal dolaşımdaki antikorlarına (IgM + IgG) bağlanmaları, bağıl floresan birimlerinde (RFU) medyan ± MAD olarak ifade edilir ve kesilmeyi aşan hayvan sayısı (≥4000 RFU). Bu tablo Bello-Gil, D. et al. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

Şekil 1: Glikan dizisi konfigürasyonunun, baskısının ve analizinin şematik gösterimi (ölçekte değil).(A) Basılı mikroçipler, 419 farklı glikan yapısından oluşan bir kütüphane ile geliştirilir, ardından uygun bir floresan etiketli ikincil antikor ile tespit edilir. Her slayt, 6 kez tekrarlanan 4 farklı alt dizi bloğu (renkli) içerir. Her bir alt dizi, kontroller dahil olmak üzere 112 f...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Antikor
Biyotinile keçi anti-insan Igs	Thermo Fisher Bilimsel, Waltham, MA, ABD	Referans #: 31782
Biyotinile keçi anti-fare IgM + IgG	Thermo Fisher Bilimsel	Referans #: 31807
ekipman
Robotik Dizileyici sciFLEXARRAYER S5	Scienion AG, Berlin, Almanya	http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/
Leke Tepsisi (slayt inkübasyon odası)	İthalat, Beloeil, QC, Kanada	Referans #: M920-2
merkezkaç	Eppendorf, Hamburg, Almanya	Referans #: 5810 R
Pipetler	Gilson, Middleton, WI, Amerika Birleşik Devletleri	http://www.gilson.com/en/Pipette/
Slayt Tarayıcı	PerkinElmer, Waltham, MA, Amerika Birleşik Devletleri	Tarama Dizisi GX Artı
Sallanan kuluçka makinesi	Cole-Parmer, Staffordshire, Birleşik Krallık	Referans #: SI50
Biyolojik örnekler
BALB/c fareler seraları	Bu kağıt	Yok
Kompleks İmmünoglobulin Hazırlığı (CIP)	Immuno-Gem, Moskova, Rusya	http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531
Kimyasallar, Reaktifler ve Glikanlar
Glikan kütüphanesi	Biyoorganik Kimya Enstitüsü (IBCh), Moskova, Rusya	Yok
Sığır serum albümini (BSA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,	Referans #: A9418
Etanolamin	Sigma-Aldrich	Referans #: 411000
Ara-20	Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, İspanya	Referans #: 655204
Fosfat tamponlu salin (PBS)	VWR International Eurolab S.L, Barselona, İspanya	Referans #: E404
Sodyum azid	Sigma-Aldrich	Referans #: S2002
Streptavidin Alexa Fluor 555 eşleniği	Thermo Fisher Bilimsel	Referans #: S21381
Streptavidin Cy5 eşleniği	GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Birleşik Krallık	Referans #: PA45001
Malzeme
N-hidroksisüksinamid türevli cam slaytlar H	Schott-Nexterion, Jena, Almanya	Referans #: 1070936
Whatman filtre kağıdı	Sigma-Aldrich	Referans #: WHA10347509
1,5 mL tüpler	Eppendorf Belediyesi	Referans #: 0030120086
Yazılım ve algoritmalar
ScanArray Express Mikrodizi Analiz Sistemi	PerkinElmer	http://www.per kinelmer.com/microarray

Gazetesi Gazetesi Gazetesi