$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Dizi Slaytını ve Kaynak Plakası Düzenini Tasarlama
- ArrayNinja arayüzündeki 'Bir slayt düzeni planla' başlığı altında, kullanılan mikrodizi yazıcıya karşılık gelen bağlantıya tıklayın.
not: ArrayNinja, yaygın olarak kullanılan iki mikrodizi yazıcının robotik hareketini taklit edecek şekilde programlanmıştır (bkz. Tablo 1). Diğer arrayer'larla uyumluluk, istek üzerine yapılandırılabilir.
- 'Yük plakası' iletişim kutusunun içine tıklayın, "boş" yazın ve 'enter'a tıklayın. ArrayNinja tasarım modülünün ekran görüntüsü için Şekil 1'e bakın.
- Spot çapını 275 μm ve spot aralığını 375 μm olarak ayarlayın. Özelliklerin mikrodizi slaytında nasıl görüneceğini özelleştirmek için kalan ayarları (Plaka Blokları/plaka sırası, Toplam plaka Satırları, çoğaltırlar, y'deki özellikler, Süper Diziler, SuperA geçiştirme; bkz. Şekil 1) ayarlayın.
not: Nokta çapı, mikrodizi piminin boyutuna göre belirlenir. Bu ayarlar ayarlandıkça, çizgi film slaytı gerçek zamanlı olarak güncellenecektir. Her bir ayarın son slayt düzenini nasıl değiştirdiğini önizlemek için bu karikatürü kullanın.
- Slayttaki unsurların düzeni tamamlandıktan sonra, fareyi her bir benzersiz unsurun üzerine getirin ve açılır iletişim kutusuna özellik tanımlayıcısını girin.
not: Özellik tanımlayıcıları sayılardan, harflerden veya kombinasyonlardan oluşabilir. Bu yalnızca benzersiz özellikler için gereklidir ve çoğaltmalar seçildiğinde bir iletişim kutusu görüntülenmez.
- Tüm benzersiz özelliklere bir tanımlayıcı atandıktan sonra, 'doldur'u tıklayın. Slayt düzeni için bir ad girin ve kaydetmek için 'plakanızı yazdırın'ı tıklayın. Seçilen slayt tasarımını üretmek için gereken 384 kuyucuklu kaynak plakalarının sayısını ve kaynak plaka(lar)ına yüklenecek her bir özelliğin fiziksel konumunu haritalayan bir tabloyu gösteren yeni bir sayfa açılacaktır.
not: Mikrodizi verilerini analiz ederken bu tasarımı hatırlamak için kullanılacağı için bu adı unutmayın. 'Plakanızı yazdırın' seçeneğine tıklamak, düzeni ArrayNinja içinde kaydeder.
2. Mikrodizilerin Üretilmesi
- Kaynak Plakasının Hazırlanması
- 384 kuyulu kaynak plaka(lar)ını oluşturmak için ArrayNinja ile oluşturulan haritayı kullanın.
NOT: Bu platformda sorgulanan peptitlerin ayrıntılı açıklamaları başka bir yerde bulunabilir.
- Her özelliğin 1 - 2 μL'sini (ör., biyotinile histon peptidi) 384 oyuklu kaynak plakasının (plakalarının) doğru kuyucuğuna koyun.
not: Biyotinile histon peptitleri tipik olarak 200 - 400 μM stok çözeltilerinden biriktirilir, bu da peptitin tek bir dizi noktasında streptavidin bağlanma bölgelerine 10 ila 25 kat molar fazlalığına eşittir. Bu, şu denklem kullanılarak hesaplanır:
burada V, bir pim tarafından sağlanan hacimdir, [P] yazdırılan özelliğin konsantrasyonudur, NA, Avogadro'nun sayısıdır ve S, bir noktanın yüzey alanıdır. C, birim alan başına streptavidin moleküllerinin sayısının üç ile çarpımı (mevcut streptavidin bağlanma bölgelerinin ortalama sayısı) olarak ifade edilen slaydın kapsamıdır. V ve C, ilgili üretici tarafından elde edilir. Diğer özellikler, kalabalıklaşmanın endişe verici olabileceği biyomolekülün boyutuna bağlı olarak farklı konsantrasyonlar gerektirebilir. Optimum baskı konsantrasyonunu belirlemek için her yeni özellik türü için bir dizi baskı konsantrasyonu ampirik olarak test edilmelidir.
- Her bir özelliği% 1 sığır serum albümini (BSA) ile desteklenmiş 1x baskı tamponu ile 10 kat seyreltin. Kaynak plakasını (plakalarını) oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 500 x g'da döndürün.
not: Floresein etiketli biyotinin (5 μg/μL) baskı tamponuna dahil edilmesi, lekelenme kontrolü ve analiz sırasında uygun dizi hizalamasını kolaylaştırmak için görsel bir yardımcı olarak önerilir (bkz. Şekil 3).
- Yazdırma Protokolü (Şekil 2A – B).
- Atık toplama kabını boşaltarak ve yıkama solüsyonu kabını ve nemlendirici kabını steril damıtılmış suyla doldurarak dizileyiciyi hazırlayın.
- ArrayNinja'daki slaytı tasarlamak için kullanılan parametreleri (Şekil 1) mikroarray yazıcı kontrol programına girin.
- Mikrodizi yazıcı kontrol programını kullanarak, yıkama prosedürünü bir daldırmada 1 sn yıkama için ayarlayın. Yıkama sonrası ayarlarını, her yıkamadan sonra pimleri 5 kez yeniden daldıracak şekilde ayarlayın. Nem oranını `'a ayarlayın.
not: Optimum yıkama yapılandırması, kullanılan mikrodizi yazıcıya bağlı olarak değişebilir. En uygun yıkama sonrası pim daldırma yapılandırması, kullanılan mikrodizi yazıcıya bağlı olarak değişebilir.
- İşlevselleştirilmiş slaytları (örn. streptavidin kaplı cam) alt tabaka plakalarına yerleştirin ve tüm plakaları merdane asansörüne yerleştirin. Kaynak plaka(lar)ını plaka tutucu(lar)ına yerleştirin ve kaynak plakası asansörüne yerleştirin.
- 'Yazdır'a tıklayın. Tüm yıkama ve daldırma ayarlarının doğru olduğundan emin olmak için birkaç tur özellik biriktirme için yazdırma işlemini izleyin. Yazdırma işlemi tamamlandığında, alt tabaka plakalarını arrayer.
not: Büyük baskı işlemleri engelleme adımlarının bir gün içinde tamamlanmasını engellediğinde, basılı slaytlar gece boyunca 4 °C'de nemlendirilmiş bir odada inkübe edilebilir. Slaytları, plastik sargı ile kapatılmış bir karton kutu içinde küçük bir su kabının yanında inkübe edin.
- Slaytları karıştırma ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca blokaj tamponu ile bloke edin.
- Slaytları 2 x 10 dakika oda sıcaklığında fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), pH 7.6 sıcaklıkta karıştırarak yıkayın. Slaytları, oda sıcaklığında 30 saniye boyunca bir mikrodizi slayt santrifüjünde döndürerek kurutun.
not: Aynı anda çok sayıda lamı işlemek için, 50 lamın paralel olarak yıkanmasına izin veren yüksek verimli bir mikroskop lam yıkama haznesi kullanılabilir.
- Balmumu ile bölümlenmek üzere tasarlanmış slaytlar için bölüm 2.1'e geçin. Diğer tüm tasarımlar için slaytları ışık ve nemden koruyarak 4 °C'de saklayın.
not: Basılı biyotinile histon peptitleri, bu şekilde saklandığında en az 6 ay boyunca stabildir.
2. Mikrodizi Slaytlarını Bölümleme
- Hidrofobik Mum Kalemi (Şekil 2C)
- Bir balmumu kalemi kullanarak özellikler içeren alanların etrafına balmumu uygulayın. Bölüm 3.
'ye geçmeden önce balmumunun 5 dakika kurumasını bekleyin
not: Engellemeden sonra, dizi noktalarının gözle görüntülenmesi çok zor olabilir. ArrayNinja'nın slayt tasarımı, ölçeğe göre yazdırılabilir ve balmumu uygulamak için bir kılavuz olarak kullanılabilir.
- Silikon conta (Şekil 2D)
- Dizi contasının arkasındaki şeffaf filmi soyun ve yapışkan tarafı aşağı bakacak şekilde mikrodizi sürgüsünün üzerine yerleştirin.
- Bölüm 5'e geçmeden önce contayı 3 saniye yerinde tutun.
- Balmumu Künye (Şekil 2E)
- Balmumu ile bölümlere ayrılmak üzere tasarlanmış slaytlar için, BSA kullanarak düz cam üzerine bir test slaydı yazdırın. Tüm özelliklerin mum kalıbı odaları içinde olmasını sağlamak için mum yazıcı kılavuzlarını veya dizi ayarlarını optimize etmek için bu test slaytını kullanın.
- Mikrodizi balmumu yazıcısını, tüm balmumu tamamen eriyene kadar, yaklaşık 30 dakika 85 °C'ye ısıtın.
- Slaytı, yazdırılan yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirin ve slaytı mikrodizi yazıcısındaki sağ kılavuza kadar itin. Kalıbı sürgünün yüzeyi ile temas ettirmek için kolu yukarı çekin. 2 s.
bekleyin
not: Optimum mum kenarlık kalınlığı elde etmek için bekletme süresi değiştirilebilir.
- Sürgüyü hızlı bir şekilde çıkarın ve tüm oyukların kapatıldığından ve kenarlıkların noktalara tecavüz edecek kadar kalın olmadığından emin olmak için balmumu kenarlıklarını görsel olarak inceleyin. Slaytları 4 °C'de nem ve ışıktan koruyarak saklayın.
not: Daha kalın veya daha ince sınırlar elde etmek için bekletme süresi artırılabilir veya azaltılabilir.
3. Bir Histon PTM Antikorunun Bir Peptit Mikrodizisi ile Hibritleştirilmesi
- Hibridizasyon tamponu hazırlayın (PBS, pH 7.6, %5 BSA, %0.1 Tween-20).
- Bir hibridizasyon kabı kullanarak hibridizasyon tamponundaki slaydı dengeleyin. Hibridizasyon tamponundaki tüm slaytı tamamen kaplayın ve düşük hızda bir orbital çalkalayıcı üzerinde 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
- Hibridizasyon tamponunda seyreltilmiş histon PTM antikoru içeren bir çözelti hazırlayın.
not: Örnek verilerde, hem histon Antikoru #1 hem de Antikor #2, hibridizasyon tamponunda 1: 1.000 oranında seyreltildi. Başlangıç noktası olarak immünoblotlama için kullanılana benzer bir seyreltme aralığı önerilir.
- Diziyi antikor çözeltisi ile 4 ° C'de 1 saat inkübe edin. Antikor çözeltisini çıkarın ve diziyi soğuk PBS, pH 7.6 ile 4 ° C'de 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
- Hibridizasyon tamponunda 1: 5.000 - 1: 10.000 oranında floresan boya konjuge ikincil antikor seyreltmesi hazırlayın.
- Diziyi ikincil antikor çözeltisi ile ışıktan korunarak 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin. İkincil antikor çözeltisini çıkarın ve mikrodizi slaytını PBS, pH 7.6 ile 4 ° C'de 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın. Mikrodiziyi, oda sıcaklığında fazla tuzu çıkarmak için 0.1x PBS, pH 7.6 içeren 50 mL'lik konik bir tüpe batırın. Slaytı oda sıcaklığında bir mikrodizi slayt santrifüjünde kurutun.
- Mikrodizi tarayıcı üreticisinin önerdiği tarama protokolünü izleyerek slaydı 25 μm veya daha yüksek çözünürlükte bir mikrodizi tarayıcı ile tarayın.
not: Floresein etiketli biyotin izleyici mevcutsa, hem yeşil kanalı (örn: 488 nm, em: 509 nm) hem de floresan boya konjuge ikincil antikoruna karşılık gelen kanalı, tipik olarak kırmızı (örn: 635 nm, em: 677 nm) tarayın. Taramanın amacı, tek bir .png dosyasında birleştirilebilen tek kanallı .tif dosyaları elde etmektir.
