1. Zebra balığı embriyolarının hazırlanması
- Öğleden sonra saat 17:00'den önce, bir dişi vahşi tip balık ve bir erkek Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] balığı ile her tankta ayırmak için bölücüler kullanarak balık geçiş tankları kurun.
- Ertesi sabah saat 11:00'den önce bölücüleri tüm geçiş tanklarından çıkarın. Sessiz olun ve çiftleşirken balıkları rahatsız etmeyin. Yumurtlama tipik olarak bölücüler çıkarıldıktan sonra 30 dakika içinde gerçekleşir. Döllenmiş yumurtalar tankın dibinde kalır.
- Döllenmiş yumurtaları tanklardan bir ağ filtresi ile toplayın. Yumurtaları yıkayarak yumurta suyuyla dolu bir Petri kabına aktarın ve embriyoları diseksiyon mikroskobu altında 10x ila 20x büyütmede inceleyin.
- Döllenmiş embriyoları yaklaşık 20 mL embriyo ortamı içeren temiz bir Petrid'e aktarın (100 mL 1.000x stok çözeltisi 29.4 g sodyum klorür (NaCl), 1.27 g potasyum klorür (KCl), 4.85 g kalsiyum klorür, dihidrat (CaCl 2.2H2O) ve 8.13 g magnezyum sülfat heptahidrat (MgSO4.7H 2O)) geniş çaplı cam Pasteur pipetleri ile. Embriyoları 28 ° C'de tutun. 28.5 ° C'de 30 mL embriyo ortamı ile Petri kabı başına 50 döllenmiş embriyo tutun.
NOT: Bir çift balık normalde 100-300 embriyo üretir ve sağlıklı embriyoların döllenme ve hayatta kalma oranı her çiftleşme için %95'in üzerindedir.
- Ertesi sabah, embriyolar döllenme sonrası ~ 18-20 saatlik gelişim aşamasına ulaştığında, embriyoları sabah 8:00'de kuluçka makinesinden çıkarın. Bunları ilk başta beyaz ışık kullanarak 20x büyütmede bir epifloresan mikroskobu altında gözlemleyin. O zaman, zebra balığı embriyoları 20 somit aşamasındadır.
- Bulanık veya yırtılmış ölü embriyoları bir cam pipet kullanarak mikroskop altında atın.
- Floresan lambayı açın ve mikroskobun kırmızı floresan proteini (RFP) filtre ayarını seçin. Ardından, güçlü kırmızı floresan ile embriyoları seçin ve yumurta suyu ile yeni bir kaba aktarın.
- Embriyoları beyaz ışık altında iki ince forseps ile (forseps uçları keskin ve hasarsız olmalıdır) manuel olarak dekoryonlayın (Malzeme Tablosu).
- Koryonu bir çift forseps ile tutun ve diğer forseps ile koryonda bir yırtık yapın. Forsepsleri kullanarak yırtığı dikkatlice açın ve diğer forsepslerin uçlarıyla embriyoyu hafifçe iterek embriyonun geçebileceği kadar büyük yapın.
- Dekoryonlu embriyoları, mikroenjeksiyondan önce hızlı bir durulama için taze embriyonik ortam içeren yeni bir Petri kabına aktarın.
2. Mikroenjeksiyonun hazırlanması
- İnce enjeksiyon iğnelerini bir çektirme üzerinde çekmek için kılcal damarları (1,2 mm dış çap (OD), 0,9 mm iç çap (ID), filamentli) kullanın. Çekme programını el kitabına göre tasarlayın ve optimize edin.
- İğnenin ucunu stereo-diseksiyon mikroskobu altında forseps ile açın. Ucun çapını 10 μm ve konik açısını 30° civarında yapın.
- Enjeksiyondan önce fare monoklonal anti-Dld antikorunu anti-Mouse-IgG-Atto647N ile konjuge edin.
- Her enjeksiyon deneyi için, 0.5 μL anti-Dld antikoru (0.5 mg / mL) ile 2 μL anti-Mouse-IgG-Atto647N antikoru (1 mg / mL) 5-10 kez pipetleyerek karıştırın. Ardından, oda sıcaklığında en az 30 dakika (veya 2-3 saat buz üzerinde) inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, antikor karışımına 2.5 μL bloke edici tampon (10 mg / mL fare IgG) ve 0.5 μL% 0.5 fenol kırmızısı ekleyin ve karışımda kalan konjuge olmayan antikorları bloke etmek için iyice karıştırmak için 10x pipetleyin.
not: Her deneme için, anti-Dld antikoru olmadan fazladan bir karışım hazırlayın ve bunu kontrol olarak kullanın.
- Embriyo ortamında% 1 düşük erime noktalı agaroz hazırlayın. Agaroz içeren karışımı 70 °C'de karışım şeffaflaşana kadar ısıtın.
- Agaroz çözeltisini 2 mL mikrosantrifüj tüplerinde alikotlayın. Alikotları ~ 40 ° C'de bir ısı bloğunda tutun.
- % 1 düşük erime noktalı agaroz içeren tüpteki embriyoyu 3 saniye boyunca durulayın.
- Embriyoyu, Şekil 1'de gösterildiği gibi her bir embriyoyu ayrı ayrı kapağa monte etmek için ayrı ayrı agaroz damlaları (~ 30-40 μL) ile birlikte ters çevrilmiş plastik bir Petri kabı kapağına yerleştirin. Embriyoları agarozun içine yanal olarak düz bir şekilde yatırın ve agaroz oda sıcaklığında katılaşana kadar bu pozisyonu koruyun.
- 12 embriyoyu yukarıdaki gibi üç sıra halinde tek tek monte edin. Agarozdaki tüm monte edilmiş embriyoları yumurta ortamı ile örtün.
3. Mikroenjeksiyon
- Gömülü embriyoları stereomikroskop altına koyun ve agarozu yumurta suyu ile kaplayın.
- Hava basıncı enjektörünü mikromanipülatörlerle birlikte, Şekil 1'de gösterildiği gibi mikroskoplara yakın yerleştirerek ayarlayın. Hava kaynağı olarak yüksek basınç altında gaz halinde nitrojen (N2) içeren çelik gaz silindirini kullanın.
- Gaz vanasını ancak embriyolar agaroza monte edildikten sonra açın. Daha sonra, mikroenjektörün ön doldurma modülünü kullanırken, Şekil 1'de gösterildiği gibi, 2 μL antikor karışımı ile hazırlanan cam iğneyi mikromanipülatör üzerine önden yükleyin.
- Giriş basıncını ~80-90 psi'ye ve enjeksiyon basıncını ~20 psi'ye ayarlayın.
- Daha önce açıklandığı gibi mikroskop altında bir mikrometre kullanarak enjeksiyon hacmini kalibre edin. İğne açıklığının boyutuna göre ayar süresini 10 ms ile 120 ms arasında olacak şekilde ayarlayın. Her bir enjeksiyon darbesini kürek üzerine dokunarak verin. Her teslimatın enjeksiyon hacmini ~ 4-5 nL'ye ayarlayın.
- Mikroenjeksiyon iğnesinin ucunu arka beyin posteriorunun dorsal çatı plakasından r0 / r1 menteşe noktasına sokun ve beyin dokusuna çarpmadan yaklaşık 10 nL (iki veya üç darbe) antikor karışımı enjekte edin. Beyin ventrikülündeki kırmızı sıvıların akışını gözlemleyin.
not: Arka beyin ventrikülü, orta beyin arka beyin sınırının arkasındadır. Enjekte edilen fenol kırmızısı içerikli antikor karışımı, beyin omurilik sıvısı ile difüze olarak beyin ventrikülünü arka beyinden ön beyne hemen doldurur.
- Enjeksiyondan sonra, mikromanipülatörün düğmesini çevirerek iğnenin ucunu embriyodan hızlı bir şekilde çıkarın. Başarılı bir enjeksiyon için, enjekte edilen karışımın kırmızı boyası, etrafı sarılmış agaroza sızmadan beyin ventrikülünde stabil bir şekilde kalır.
- Tekrarlar için uygun bir pozisyonda başka bir monte edilmiş embriyoyu bulmak için montaj plakasını mikroskop altında hareket ettirin.
- Altı ila sekiz embriyoyu enjekte ettikten sonra, embriyoları gömülü agarozdan çıkarmak için agarozu bir mikrocerrahi bıçakla soyun. Mikroenjekte edilen embriyoları 30 mL embriyo ortamı içeren taze bir tabağa aktarın ve sonraki adımlar için oda sıcaklığına yerleştirin.
4. Montaj ve hızlandırılmış canlı görüntüleme
- 30 dakika sonra, seçilen embriyoları 10 mL embriyo ortamına aktarın. Embriyoları uyuşturmak için 10 mL embriyo ortamına 420 μL trikain stoğu (4 mg / mL) ekleyin.
- Embriyoları monte etmek için, tüpte aynı konsantrasyonda trikain içeren% 0.8 düşük erime noktalı agaroz hazırlayın. Alikotları ~ 40 ° C'de bir ısı bloğunda tutun.
- Enjekte edilen embriyoları 3 saniye boyunca ılık agaroza batırmak için bir cam pipet kullanın. Daha sonra aynı cam pipet ile embriyoları hemen agarozdan çıkarın ve embriyoları tüpten bir damla agaroz ile 35 mm'lik cam tabanlı kültür kaplarının ortasına yerleştirin. Camın üzerine damla başına sadece bir embriyo yerleştirin.
- Embriyonik beynin sırt tarafını cam tabana mümkün olduğunca yakın tutmak için embriyoları bir fiber prob veya yükleme ucu ile nazikçe yönlendirin. Agaroz yavaş yavaş katılaşırken embriyoyu kıvrılmadan uzatmak için embriyo pozisyonunu nazikçe ayarlayın.
- Daha sonra, cam alt tabağı ters çevirerek embriyo konumunu kontrol edin. Doğru şekilde monte edilmiş embriyoların bulunduğu tüm dorsal ön beynin mikroskop altında görülebildiğinden emin olun.
- Embriyoyu kaplamak için 2-3 mL 28.5 °C önceden ısıtılmış trikin içeren embriyonik ortam ekleyin. Çanağı, Şekil 1'de gösterildiği gibi konfokal mikroskobun sıcaklık kontrollü aşamasına düzgün bir şekilde yerleştirin. Görüntüleme odasının sıcaklığını 28,5 °C olacak şekilde ayarlayın. Embriyo artık görüntüleme için hazırdır.
