1. İmmünolokalizasyon
NOT: Floresan immünolokalizasyon prosedürü, iki antikorun ardışık kullanımına dayanır. Primer antikor, spesifik bir hedef antijene karşı yükseltilir. İkincil antikor, spesifik olarak birincil antikora karşı yükseltilir ve floresan teknikler için bir florofora konjuge edilir (bu spesifik protokolde FITC [floresein izotiyosiyanat]). Birincil antikor, numunedeki hedef antijeni tespit etmek için kullanılacak ve ikincil antikor, birincil antikorun fazlalığını yıkadıktan sonra birincil antikorun numuneye bağlandığı yeri işaretlemek için kullanılacaktır. Kontroller bu testin önemli bir parçasıdır ve gözlemlerin doğruluğunu sağlamak için her zaman yapılmalıdır. Slayttaki bir kuyucuk, birincil antikor tedavisinin atlanacağı negatif kontrol olarak kullanılmak üzere ayrılmalı ve bu nedenle deneyin sonunda herhangi bir sinyal gözlenmemelidir. Pozitif bir kontrol, etiketlemesi zaten bilinen ve kesin olan bir antikorla iyi bir şekilde muamele edilerek deneye dahil edilmelidir. Pozitif kontrol, ikincil antikor etiketleme etkinliğini ve reaksiyon koşullarını doğrulamak için kullanılırken, negatif kontrol ikincil antikor özgüllüğünü test eder.
- Bir pipet ucu kutusunun altına biraz nemli kağıt havlu koyarak ve kalay folyo ile sararak bir kuluçka odası hazırlayın (Şekil 1B-1E). Slaytları inkübasyon odasına yerleştirin.
- 8 mm'lik blokaj çözeltisi kuyucuğu başına 50 μL'lik bir damla pipetleyin (1 M fosfat tamponlu salin [PBS] içinde% 5 yağsız kuru süt (a/h)) ve 10 dakika inkübe edin. Blokaj solüsyonunu çıkarın ve tüm kuyucukları PBS ile iki kez 10 dakika boyunca yıkayın.
- Primer antikor solüsyonlarını hazırlayın (bakınız Tablo 1), bloke edici solüsyonda 1: 5 (v / v) antikor; 8 mm'lik kuyu başına yaklaşık 40 μL'lik bir tahminde bulunun.
not: Antikorun konsantrasyonu, üreticinin protokolüne göre ayarlanmalıdır.
- 5 dakika boyunca çift damıtılmış su (ddH2O) ile son bir yıkama yapın, kuyuların tamamen kurumasına asla izin vermeyin.
- Birincil antikor çözeltisini reaksiyon kuyucuklarına pipetleyin. Kontrol kuyularına pipet engelleme solüsyonu.
- İnkübasyon odasını kapatın ve oda sıcaklığında 2 saat bekletin, ardından gece boyunca 4 °C'de bekletin. İkincil antikor solüsyonunu, kuyucuk başına yaklaşık 40 μL bloke edici solüsyonda (h/h) %1 olacak şekilde hazırlayın. Kalay folyo ile kapalı tutun.
- Tüm kuyucukları PBS ile 10 dakika boyunca iki kez yıkayın, ardından ddH2O ile 10 dakika daha yıkayın. Kuyucuklarda blokaj çözeltisinin veya tortuların izinin görünmediğinden emin olun.
- İkincil antikor solüsyonunu tüm kuyucuklara pipetleyin. Şu andan itibaren slaytları ışıktan koruyun.
- Karanlıkta oda sıcaklığında 3-4 saat inkübe edin.
- Tüm kuyucukları PBS ile 10 dakika boyunca iki kez yıkayın, ardından ddH2O ile 10 dakika daha yıkayın.
- Her oyuğa bir damla kalkoflor (1: 10.000 (a/h) floresan daha parlak 28 PBS) uygulayın. Yıkamadan, her bir oyuğa bir damla montaj ortamı (Malzeme Tablosuna bakınız) uygulayın ve bir lamel yerleştirin (Şekil 2H).
- 10x/0.45, 20x/0.75, 40x/0.95 ve 100x/1.40 lens ile donatılmış bir floresan mikroskobu ile gözlemleyin, sırasıyla hücre duvarını ve immünolokalizasyonu tespit etmek için UV (kalkoflor lekesi için) ve FITC filtreleri kullanın (Şekil 2I). Aşağıdaki dalga boylarını kullanın: UV için uyarma/emisyon (nm) 358/461 ve FITC için 485/530.
- Sonuçların daha iyi görselleştirilmesi için, her iki görüntüyü de ImageJ veya benzeri bir şeyle örtüştürün.
Tablo 1: Yararlı monoklonal antikorların listesi. Yukarıdaki tablo, hedefleri ve nereden satın alınabilecekleri hakkında bilgilerle birlikte mevcut antikorların bir örneğini temsil etmektedir.
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
| ad | ilgi | Şu adresten ulaşılabilir: |
| LM2 | Arabinogalaktan proteini | Bitki probları (Leeds, İngiltere) |
| LM5 | Pektinler |
| LM6 | Arabinan |
| LM7 | Homogalakturonan |
| LM8 | Ksilogalakturonan |
| LM13 | (1-5)-a-L-ARABINAN |
| LM14 | Arabinogalaktan proteini |
| LM16 | İşlenmiş Arabinan - RG-I |
| LM18 | Homogalakturonan |
| LM19 | Homogalakturonan |
| LM20 | Homogalakturonan |
| LM26 | DALLI-GALAKTAN |
| LM30 | Arabinogalaktan proteini |
| JIM5 | Düşük metil-esterlenmiş homogalakturonan | CCRC (Gürcistan, ABD) |
| JIM7 | Yüksek derecede metil-esterlenmiş homogalakturonan |
| JIM4 | Arabinogalaktan proteini |
| JIM8 | Arabinogalaktan proteini |
| JIM13 | Arabinogalaktan proteini |
| JIM15 | Arabinogalaktan proteini |
| JIM16 | Arabinogalaktan proteini |
| JIM20 | Genişletme |
| MAC207 Tezli Yüksek Lisans | Arabinogalaktan proteini |
