Bir aşıdaki immünojenik glikoprotein içeriğini belirlemek için bir sandviç ELISA kullanmak

Özet

Kaynak: Jallet, C. et al., Kuduz Aşısı Potansiyelini Değerlendirmek için İn Vitro ELISA Testi. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu video, aşılardaki immünojenik glikoprotein seviyelerini değerlendirmek için tasarlanmış dolaylı bir enzime bağlı immünosorbent testi veya ELISA sandviç immünocapture testini göstermektedir. Glikoproteine özgü antikorlar içeren tahlil plakası, referans ve test aşıları dahil olmak üzere seri olarak seyreltilmiş aşı numuneleri ile inkübe edilir, ardından test aşısındaki glikoprotein içeriğini ölçmek için immünolojik test yapılır.

Protokol

1. Güvenlik önlemleri

NOT: Bu yöntem hem canlı kuduz virüsü (RABV) hem de inaktif aşı için geçerlidir.

1. İyi Laboratuvar Uygulamaları ve Güvenlik prosedürlerini kullanın.
2. Tek kullanımlık mont, eldiven, maske, gözlük vb. dahil olmak üzere yeterli Kişisel Koruma Ekipmanı (KKD) kullanın.
3. Canlı virüs titre edildiğinde, sınıf II biyolojik güvenlik kabini kullanın.
   1. Numunelerle temas eden herhangi bir malzemeyi (reaktifler, yıkama solüsyonları vb.) bulaşıcı materyal olarak kabul edin.
   2. Kirlenmiş malzemeyi, dekontaminasyon için 2,5 dakika boyunca ağartıcı solüsyona (sodyum hipokloritin% 30'i) batırarak işlemden geçirin.
4. Kimyasalları iyi laboratuvar uygulamalarına uygun olarak kullanın.

2. Hazırlık

1. Mümkün olan her yerde analitik dereceli reaktifler kullanın.
2. Kaplama tamponu/karbonat tamponu, pasivasyon tamponu, seyreltici ve sitrat tamponunun taze çözeltilerini hazırlayın (Tablo 1), 0,45 veya 0,22 μm filtrelerden süzün ve analitik saflıklarını korumak için kullanımdan önce bir gün boyunca 4 °C'de saklayın.
3. Kullanımdan 30 dakika önce reaktiflerin oda sıcaklığına (+18 °C ila +25 °C) ulaşmasını bekleyin ve kullanımdan önce nazikçe karıştırarak homojen hale getirin.

3. Mikroplaka duyarlılığı

NOT: Yüksek miktarda İmmünoglobulinleri bağlamak için optimize edilmiş 96 iyi adsorpsiyon immünoassay plakası kullanın (örneğin, bkz. Malzeme Tablosu).

1. Her oyuklara, karbonat tamponunda seyreltilmiş 200 μL monoklonal antikor (mAb-D1) ekleyin.
   NOT: Deneysel olarak yaklaşık 1 μg/mL'lik bir optimal konsantrasyon belirlenmiştir ve saflaştırılmış mAb-D1'in yaklaşık 1/2000 seyreltilmesine karşılık gelir. Bu önerilen konsantrasyon, her mAb-D1 partisi için endikedir ve pozitif kontrol ile periyodik olarak doğrulanmalıdır.
2. Plakayı yapışkan bir filmle örtün ve mikroplakayı nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C'de 3 saat inkübe edin.
3. Kuyu içeriğini dikkatlice aspire edin ve %2,5 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya aktarın.
4. Mikroplakayı ters çevirin ve emici bir kağıt üzerinde oda sıcaklığında 5 dakika kurumaya bırakın.

4. Mikroplaka pasivasyonu

1. Her kuyucuğa 300 μL pasivasyon tamponu ekleyin.
2. Plakayı yapışkan bir filmle örtün ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
3. Dikkatlice aspire edin ve kuyu içeriğini% 2,5 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya aktarın.
4. Mikroplakayı ters çevirin ve oda sıcaklığında emici bir kağıt üzerinde 1 dakika kurumaya bırakın.
   NOT: Mikroplaka hemen kullanılabilir veya kullanıma kadar 3 aya kadar -20 °C'de kapalı olarak saklanabilir.

5. ELISA testi

NOT: Referans aşının kontrol eğrisini oluşturmak için Adım 5.3'e gerek yoktur; Test edilen aşıyı titre etmek için 5.1 ila 5.6 arasındaki tüm adımlar gereklidir.

1. Hassaslaştırılmış mikroplakanın yıkanması
   1. Her kuyucuğa 300 μL yıkama tamponu ekleyin.
   2. Dikkatlice aspire edin ve kuyu içeriğini% 2,5 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya aktarın.
   3. Hassaslaştırılmış plakayı kapsamlı bir şekilde yıkamak için 5.1.1 ve 5.1.2 adımlarını beş kez daha tekrarlayın.
   4. Mikroplakayı ters çevirin ve oda sıcaklığında adsorban bir kağıt üzerinde 1 dakika kurumaya bırakın.
2. Kontrol eğrisi için referans aşının seyreltmeleri
   1. Referans aşıyı (validasyon antijeni Lot 09), 10 μg/mL kuduz virüsü glikoprotein konsantrasyonuna karşılık gelen 1 mL damıtılmış su içinde sulandırın.
   2. 1 μg/mL kuduz virüsü glikoproteinine ulaşmak için seyrelticide sulandırılmış referans aşının on kat seyreltmesini hazırlayın.
   3. Tablo 1'da belirtildiği gibi seyrelticide bu referans aşının 6 seri iki kat seyreltmesini hazırlayın.
   4. Boş bir kontrol görevi görmesi için 200 μL seyrelticiyi iki katına (kuyu 1H/2H) dağıtın.
   5. Her bir referans aşı seyreltmesinin oyuklu başına 200 μL'yi iki nüsha halinde dağıtın (G1/G2 ila A1/A2 kuyuları).
3. Titrasyonu için test edilen aşının seyreltilmesi
   1. Seyrelticide test edilen aşının on kat seyreltilmesini hazırlayın.
   2. Tablo 2'de belirtildiği gibi seyreltici içinde test edilen aşının 7 adet iki katlı seri seyreltmesini hazırlayın.
   3. Test edilen her aşı seyreltmesinin kuyucuğu başına 200 μL'yi iki parça halinde dağıtın (H3/H4 ila A3/A4 kuyuları).
4. ELISA plakasının inkübasyonu/yıkanması
   1. Mikroplakayı yapışkan bir filmle örtün ve 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
   2. Filmi çıkarın, dikkatlice aspire edin ve her bir oyuğun içeriğini% 2,5 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya aktarın.
   3. Her kuyucuğa 300 μL yıkama tamponu ekleyin.
   4. Dikkatlice aspire edin ve her bir oyuğun içeriğini% 2,5 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya aktarın.
   5. Bağlanmamış antijeni çıkarmak ve kaplanmış antikora (mAb D1) bağlı G protein trimerlerini korumak için 5.4.3 ve 5.4.4 adımlarını beş kez tekrarlayın.
   6. Mikroplakayı ters çevirin ve emici bir kağıt üzerinde oda sıcaklığında 1 dakika kurumaya bırakın.
5. Peroksidaz konjuge mAb-D1'in bağlanması
   1. Seyreltici (yaklaşık 1μg/mL konsantrasyon) içinde peroksidaz etiketli mAb-D1'in önerilen seyreltmesinin (1/2000) oyuğu başına 200 μL dağıtın. Her mAb-D1 partisi için önerilen bir konsantrasyon belirtilmiştir ve pozitif kontrol ile periyodik olarak doğrulanması gerekir.
   2. Mikroplakayı yapışkan bir filmle örtün ve 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
   3. Filmi çıkarın, dikkatlice aspire edin ve her bir oyuğun içeriğini% 2,5 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya aktarın.
   4. Her kuyucuğa 300 μL yıkama tamponu ekleyin.
   5. Dikkatlice aspire edin ve her bir oyuğun içeriğini% 2,5 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya aktarın.
   6. Bağlanmamış peroksidaz etiketli antikoru (mAb D1) çıkarmak için 5.5.4 ve 5.5.5 adımlarını beş kez tekrarlayın.
   7. Mikroplakayı ters çevirin ve emici bir kağıt üzerinde oda sıcaklığında 1 dakika kurumaya bırakın.
6. Bir substrat-kromojen kullanarak vahiy
   1. Substrat-kromojen çözeltisinin oyuğu başına 200 μL dağıtın.
   2. Mikroplakayı bir filmle kapatın ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Yoğunluğu bağlı peroksidaz etiketli antikorların (mAb D1) miktarı ile orantılı olan sarı-turuncu bir renk gelişir.
   3. Kuyucuk başına 50 μL durdurma çözeltisi ekleyerek reaksiyonu durdurun.
   4. Kullanılan tüm kuyucukların 492 nm'deki optik yoğunluğunu (OD) belirlemek için mikroplakanın altını dikkatlice silin ve bir spektrofotometreye yerleştirin: negatif kontrol (boş), referans aşı ve test edilmiş aşı.
   5. Analiz için OD verilerini .xls veya .xlsx dosya biçiminde toplayın.

Tablo 1. Tahlilde kullanılan tamponlar.

ile ayarlayın 1x PBS'de 80 ml soğutulmuş distile su içinde

Tamponlar ve reaktifler	Hazırlık
Kaplama tamponu (Karbonat tamponu 50mM pH=9.6)	Sodyum bikarbonata 50 mM (Na2CO3-10H2O) Sodyum bikarbonat 50 mM'ye (NaHCO3) istenen pH'a kadar ekleyin (yaklaşık 1/10 sodyum bikarbonat)
Pasivasyon tamponu	% 0.3 Sığır Serum Albümini (BSA, fraksiyon V), karbonat tamponunda %5 sükroz 50 mM pH 9.6
10x Fosfat tamponlu tuzlu su pH=7 (PBS 10x)	NaCl 80 g, KCl 2 g, Na2PO4-12H2O 11.33 g, KH2PO4 1L damıtılmış suda 2g. pH=7'yi 4N NaOH
Yıkama tamponu	%0.05 Ara
Seyreltici	% 0.5 Sığır Serum Albümini (Fraksiyon V), 1x PBS'de% 0.05 Tween (BSA ile asitleştirme nedeniyle pH'ı 7'ye ayarlayın)
Sitrat tamponu pH-5.6 (peroksidaz substratı için)	11.67 g Tri-sodyum sitrat-2H2O (Na3C6H5O7-2H20), 2.17 g Sitrik asit-1H20 1L damıtılmış suda
Substrat-kromojen çözeltisi	50 mg Orto-fenilen diamin tableti, %0.1 Hidrojen peroksit %30 (110 hacim) 25 ml Sitrat tampon pH 5.6
Çözümü durdurma (4N sülfürik asit)	10 ml H2SO4 36N. Seyreltme bir buz banyosunda yapılmalıdır

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sınıf II Biyolojik Güvenlik Kabini	ThermoFisher Bilimsel	10445753	Canlı virüs titre ediliyorsa
Şeffaf Düz Tabanlı İmmüno Nonsteril 96 Kuyulu Plakalar, 400 μL, MAXISORP	ThermoFisher Bilimsel	439454	Yüklenen antikora bağlanmak için iyi
Labo Polipropilen Laboratuvar Çeker Ocaklarını Donatın	ThermoFisher Bilimsel	12576606	Sülfürik asit hazırlanması için
İmmünoloji Plakası Güçlü Adsorpsiyon MAXISORP Düz Tabanlı Kuyu F96	Dutscher	55303	Yüklenen antikora bağlanmak için iyidir
Mikroplaka Sızdırmazlık Bandı(100 yaprak)	ThermoFisher Bilimsel	15036
Mikroplaka tek modlu okuyucu Gündoğumu	TECAN
Mikroplaka çalkalayıcı-inkübatör	Dutscher	441504
Mikroplaka yıkayıcı Kuyu yıkama	ThermoFisher Bilimsel	5165000
Çok kanallı pipet (30-300 μL) 12 kanal	ThermoFisher Bilimsel	4661180N
Tek Kanallı pipetler (Kit 2 : Finnpipettes F2 0,2-2 μL mikro, 2-20 μL, 20-200 μL ve 100-1000 μL)	ThermoFisher Bilimsel	4700880