$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Manyetik Nanopartiküllerin (MNP'ler) Birleştirilmesi
- MNP'leri antikorlarla (Abs) (tipik olarak 1 mg) birleştirmek için ticari birleştirme prosedürü ve reaktifler kullanın. Reaktif gruplar olarak karboksilik asit içeren demir oksit nanopartikülleri kullanılır.
- Antikorlar 0.5 ml'den daha yüksek bir hacimdeyse, 100K'lık bir yoğunlaştırıcı kullanarak konsantre olun. 3-5 dakika boyunca 2.000 x g'da döndürün.
- İşlemin sonunda, 10 μl söndürme tamponu ekledikten sonra, MNP'leri 12 mm x 75 mm'lik bir tüpe aktarın ve 3 ml yıkama / depolama tamponu ekleyin. Tüpü manyetik bir ayırıcının orta deliğine yerleştirin ve gece boyunca 4 °C'de bırakın.
- MNP'lerin hepsinin tüpün yan tarafında toplandığını doğrulayın ve ardından tüm sıvıyı dikkatlice pipetleyin. 3 ml taze yıkama / saklama tamponu ekleyin ve mıknatısa geri yerleştirin.
- Birkaç saat sonra, MNP'lerin tüpün yan tarafında toplanıp toplanmadığını kontrol edin ve ardından sıvıyı pipetleyin. MNP'leri yeniden süspanse etmek ve 4 °C'de saklamak için 2 ml yıkama/saklama tamponu kullanın.
- Abs'nin MNP'lere bağlı olduğunu, bunları ilgili bir floresan Fab antikor fragmanı ile etiketleyerek doğrulayın (örneğin, bölüm 2'de açıklandığı gibi yakalama için bir fare monoklonal Ab kullanılıyorsa keçi anti-faresi) ve bir akış sitometresi üzerinde çalıştırın.
2. MNP'lere Bağlı Antikorların Etiketlenmesi
- 60 μl (3.9 x 1012 parçacık) MNP'leri (koşul başına) ve 5 μl (200 μg / ml'lik bir ticari çözeltiden) etiketli Fab fragmanlarını, 1.5 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpünde yakalama Ab'nin izotipine özgü olarak birleştirin.
- Sürekli karıştırma ile oda sıcaklığında (RT) 30 dakika inkübe edin.
- 100K'lık bir yoğunlaştırıcıyı 300 μl fosfat tamponlu salin (PBS) ile önceden ıslatın ve 5 dakika boyunca 1.500 x g'da bir mikrosantrifüjde döndürün.
- 100K sütunundaki etiketli kompleksleri saflaştırın. Karışımı adım 2.2'den itibaren 1.500 x g'da 5 dakika boyunca bir mikrosantrifüjde döndürün, 200 μl PBS ile yıkayın ve ilk hacimde geri kazanın.
3. İlgilenilen Parçacıkları Yakalamak için Etiketli Ab-MNP Komplekslerinin Kullanımı (Hücre Dışı Veziküller, EV'ler)
- Önceden etiketlenmiş MNP'leri 60 μl (3.9 x 1012 parçacık) EV hazırlığı (100 μl) ile inkübe edin.
- EV hazırlıklarını çeşitli yöntemler kullanarak hazırlayın. Burada, EV'leri sakaroz gradyanlarında saflaştırın, bunları eksozom çökeltme reaktifleri kullanarak trombositten fakir plazmadan toplayın veya doğrudan plazmadan izole edin.
not: Her deney için optimal oranların belirlenmesi gerekir ve bunlar hazırlıktaki EV konsantrasyonuna bağlıdır. MNP-Ab fraksiyonu, EV fraksiyonunun konsantrasyonuna kıyasla ~10 6 fazla olmalıdır.
- EV'ler için 4 °C'de 1 saat inkübe edin.
- Fc bağlanmasını engellemek için% 2,5 fare IgG / insan IgG ekleyin, hafifçe girdap, RT'de 3-5 dakika inkübe edin.
- Her bir algılama Abs'nin üretici tarafından önerilen veya titrelenmiş konsantrasyonlarını ekleyin ve RT'de 20 dakika daha inkübe edin.
4. MNP ile yakalanan EV'lerin Manyetik Sütunlar Kullanılarak Bağlanmamış Antikorlardan Ayrılması
- Manyetik ayırma kolonunu bir ayırıcı mıknatısa yerleştirerek kullanım için hazırlayın.
- Kolonu 500 μl yıkama tamponu (2 mM Etilendiamintetraasetik asit (EDTA), PBS'de %0.5 sığır serum albümini (BSA)) ile önceden ıslatın. Yıkama tamponunun kolondan akmasına izin verin.
- MNP-EV komplekslerini kolona ekleyin ve tüm sıvının akmasına izin verin. Kolona 500 μl yıkama tamponu ekleyin ve tüm hacmin geçmesine izin verin.
- Yıkama tamponu ile yıkamayı 2 kez daha tekrarlayın.
- Kolonu mıknatıstan çıkarın ve tutulan MNP-EV komplekslerinin toplanması için 12 mm x 75 mm'lik tüpe yerleştirin. Sütunun mıknatısın tüpünde 3 dakika beklemesine izin verin. 200 μl PBS ekleyin ve boncukların yerçekimi ile aşağı akmasına izin verin, 200 μl daha PBS ekleyin ve elüsyondan sonra 200 μl% 4 paraformaldehit ile sabitleyin.
not: Paraformaldehit şüpheli bir kanserojendir ve havalandırmalı bir başlıkta kullanılmalı ve eldiven giyilmelidir.
- Tek EV'leri ölçmek için Yüksek Verimli Örnekleyicide (HTS) hacimsel ayarları kullanın veya alımdan hemen önce iyi karıştırılmış akış sitometrisi sayım boncukları ekleyin.
5. MNP'ler tarafından yakalanan EV'lerin Akış Sitometresi ile analizi
- Akış sitometresini 30 dakika ısıtın.
- Kalite kontrol boncuklarını çalıştırın.
- MNP'lerin veya etiketli EV'lerin floresan eşiğini ayarlayın. Arka plan "gürültüsünü" azaltmak için eşik için 0,22 μm filtrelenmiş PBS kullanın. PMT voltajını, filtrelenmiş PBS'nin hiç olay vermediği veya çok az olay verdiği seviyede ayarlayarak eşiği ayarlayın.
- Örnekleri düşük seviyede çalıştırın. (Yanlış olayları daha da ortadan kaldırmak için standart 0,2 μm kılıf filtrenin arkasına seri olarak yerleştirilen kılıf sıvısı için ek bir 0,04 μm hat içi filtre kullanın).