$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Biyolojik Numune Hazırlama
NOT: Seçilen anatomik bölge ve kan alma hacmi her bir araştırmacının takdirine bırakılmıştır ve testin sonucunu etkilemeyecektir. Bununla birlikte, bir kez elde edildikten sonra, numuneler aşağıda listelenen adımlara göre ele alınmalıdır.
- Serum Örneklerinin Hazırlanması
- İstenilen hacimde kanı tercih edilen toplama tüpüne toplayın ve en az 30 dakika pıhtılaşmasına izin verin.
- Numuneyi oda sıcaklığında 1.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.
- Serumu ve tahlili hemen çıkarın veya polipropilen mikrosantrifüj tüplerine alın ve numuneleri ≤ -20 ° C'de saklayın.
- Plazma Numunelerinin Hazırlanması
- Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) kaplı kan alma tüplerini kullanarak istenen hacimde kan toplayın.
- Toplandıktan sonraki 30 dakika içinde oda sıcaklığında 1.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.
- Plazmayı ve tahlili hemen çıkarın veya polipropilen mikrosantrifüj tüplerine alın ve numuneleri ≤ -20 °C'de saklayın.
- Doku Kültürü Süpernatan Örneklerinin Hazırlanması
- Hücreleri ve kalıntıları temizlemek için numuneyi 1.500 x g'de 4 dakika
santrifüjleyin.
- Süpernatanı toplayın ve hemen test edin veya polipropilen mikrosantrifüj tüplerine alın ve ≤ -20 ° C'de saklayın.
- Dondurulmuş Biyolojik Örneklerin Çözülmesi
- Kullanmadan önce önceden donmuş biyolojik numuneleri buz ve girdap üzerinde tamamen çözün. 2'den fazla donma/çözülme döngüsünden kaçının.
not: Bu protokolde kullanılan örnekler, BALB/c fare splenositlerinin (37 °C'de 1 x 106 hücre + %5 CO2 olmak üzere çeşitli koşullar altında kültürlenmesiyle elde edilmiştir: uyarılmamış, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 μg/mL plaka kaplı) + αCD28 (1 μg/mL çözünür), PMA (20 ng/mL) + İyonomisin (500 ng/mL). Kültür süpernatanları 48 saat sonra toplandı ve bölüm 1.3'te tarif edildiği gibi işlendi.
2. Reaktif Hazırlama
- Önceden Karıştırılmış Antikorla İmmobilize Edilmiş Boncukların Hazırlanması
- Önceden karıştırılmış boncuk şişesini oda sıcaklığında bir sonicator banyosunda 1 dakika boyunca sonikate edin ve daha sonra kullanmadan önce 30 saniye boyunca girdap yapın. Sonikatör banyosu yoksa, girdap süresini 1 dakikaya çıkarın.
- Yıkama Tamponunun Hazırlanması
- Kit ile birlikte verilen 20x Yıkama Tamponunu (%1 Tween-20 ile 20x PBS) oda sıcaklığına getirin ve tüm tuzları çözeltiye getirmek için girdap yapın.
- 25 mL 20x Yıkama Tamponunu 475 mL deiyonize su ile seyreltin. Kullanılmayan kısımları 2 °C ile 8 °C arasında bir aya kadar saklayın.
- Matris B'nin Hazırlanması (Yalnızca Serum ve Plazma Numuneleri ile Kullanım İçin)
- Kitte bulunan 5.0 mL Test Tamponu (% 1 BSA içeren PBS) liyofilize Matris B içeren şişeye ekleyin. Tam sulandırma için en az 15 dakika bekleyin, ardından iyice karışması için girdap yapın. Artık sulandırılmış Matrix B, ≤ -70 °C'de bir aya kadar saklanabilir.
3. Standart Hazırlık
NOT: Bu paneldeki her analitin en yüksek standart konsantrasyonu 10.000 pg/mL'dir.
- Liyofilize Fare Th Sitokin Standart Kokteylini sulandırmak için 250 μL Test Tamponu ekleyin. Kısa bir süre girdap yaparak karıştırın ve şişeyi oda sıcaklığında 10 dakika
bekletin.
- Standart kokteyli "C7" etiketli bir polipropilen mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bu, en üst standart olarak kullanılacaktır.
- 6 polipropilen mikrosantrifüj tüpünü C6, C5, C4, C3, C2 ve C1 olarak etiketleyin.
- Bu tüplerin her birine 75 μL Test Tamponu ekleyin.
- En üst standart C7'nin 25 μL'sini C6 tüpüne aktarın ve girdaplama ile iyice karıştırın. Bu C6 standardı olacaktır.
- Bir sonraki en düşük standart tüpteki 75 μL Test Tamponuna önceki standarttan 25 μL eklemek için her tüp için yeni bir pipet ucu kullanarak seri 1: 4 seyreltme yapmaya devam edin, ardından C5, C4, C3, C2 ve C1 standartlarını elde etmek için girdaplama yapın. Tahlil Tamponunu 0 pg/mL standardı (C0) olarak kullanın.
4. Örnek Seyreltme
NOT: Belirli bir biyolojik numune seti için en uygun seyreltme faktörünü belirlemek için bu testi birden fazla seyreltme ile kullanan ön pilot deneyler gerekebilir. Uygun bir seyreltme faktörü, standart eğrinin sınırları içinde kalan numune için konsantrasyon hesaplamaları üretecektir. Aşağıdaki adımlar kılavuz niteliğindedir ve numune türüne bağlı olarak ampirik olarak belirlenmesi gerekebilir.
- Serum veya plazma örneklerini Tahlil Tamponu ile 2 kat seyreltin (ör. polipropilen mikrosantrifüj tüplerinde 50 μL numuneyi 50 μL Test Tamponu ile seyreltin).
not: Daha fazla numune seyreltmesi gerekiyorsa, doğru ölçümü sağlamak için seyreltmeler test tamponu yerine Matris B ile yapılmalıdır. Serum veya plazma numunelerinin seyreltilmeden eklenmesi, düşük tahlil doğruluğuna neden olur ve filtre plakasını tıkayabilir. Matris B, endojen tahlil hedeflerinden yoksun havuzlanmış fare serumundan oluşur. İmmünoanalizlerin analitik duyarlılığını etkilediği bilinen matris etkilerinden kaçınmak için bir serum veya plazma numunesi seyrelticisi olarak kullanılır.
- Hücre kültürü süpernatan örneklerini seyreltmeden test edin.
not: Analit seviyeleri numuneden numuneye büyük ölçüde değişebilir. Gerekirse, süpernatan numuneleri, karşılık gelen hücre kültürü ortamının veya Test Tamponunun taze bir preparatını kullanarak seyreltin.
5. Tahlil Prosedürü
NOT: Test, polipropilen filtre plakalarında, mikro floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) tüplerinde veya V tabanlı mikroplakalarda gerçekleştirilebilir. Numuneden numuneye iyi tutarlılık, test sağlamlığı ve kullanım kolaylığı nedeniyle filtre plakası tahlil prosedürü önerilir. Bu prosedür, yıkama için bir vakum filtrasyon ünitesi gerektirir (son kullanıcı tarafından sağlanır).
- Kullanmadan önce tüm reaktiflerin oda sıcaklığına (20 - 25 °C) ısınmasını bekleyin.
- Tahlil kurulumu ve inkübasyon adımları sırasında filtre plakasını her zaman ters çevrilmiş bir plaka kapağına yerleştirin, böylece plakanın alt kısmı sızıntıya neden olabileceğinden herhangi bir yüzeye temas etmez.
- Boncukların kaybolmasını önlemek için yıkama adımları da dahil olmak üzere tüm tahlil prosedürü boyunca plakayı dik tutun.
- Tüm inkübasyon adımları için plakayı karanlıkta tutun veya alüminyum folyo ile sarın.
- Tüm standartları ve numuneleri plaka üzerinde sıralı bir sırayla düzenlenmiş kopyalar olarak çalıştırın.
- Her bir kuyucuğa 100 μL 1x Yıkama Tamponu ekleyerek filtre plakasını önceden ıslatın ve oda sıcaklığında 1 dakika bekletin (filtre tabanlı mikroplaka kullanılıyorsa).
- Vakum manifoldunu (5 - 10 s) kullanarak tampon hacmini çıkarın. 10 " Hg vakumu aşmayın. Plakayı bir yığın temiz kağıt havluya bastırarak plakanın altındaki fazla Yıkama Tamponunu kurulayın. Plakayı ters çevrilmiş plaka kapağının üzerine yerleştirin.
not: Test bir V-tabanlı mikroplaka veya mikro FACS tüpleri kullanılarak gerçekleştirilirse, 5.1 - 5.2 adımları atlanabilir.
- Hücre kültürü süpernatan numuneleri için, tüm kuyucuklara 25 μL Test Tamponu ekleyin. Standart kuyucuklara her standarttan 25 μL ekleyin. Numune kuyucuklarına her numuneden 25 μL ekleyin.
- Serum veya plazma örneklerini ölçmek için standart kuyucuklara 25 μL Matrix B ekleyin. Numune kuyucuklarına 25 μL Test Tamponu ekleyin. Standart kuyucuklara her standarttan 25 μL ekleyin. Numune kuyucuklarına her seyreltilmiş serum veya plazma numunesinden 25 μL ekleyin.
- Karışık boncukları 30 saniye boyunca vorteksleyin. Her oyuğa 25 μL karışık boncuk ekleyin, boncuk çökelmesini önlemek için boncuk şişesini aralıklı olarak sallayın. Boncukların eklenmesinden sonra her bir kuyucukta nihai hacim 75 μL olmalıdır.
- Plakayı bir plaka kapatıcı ile kapatın. Ters çevrilmiş plaka kapağı da dahil olmak üzere tüm plakayı alüminyum folyo ile sarın. Plakayı bir plaka çalkalayıcıya yerleştirin, sabitleyin ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca yaklaşık 500 rpm'de çalkalayın. Sızıntıyı önlemek için, plaka kapatıcıya pozitif basınç uygulamayın.
- Ters çevirmeden, plakayı vakum manifoldunun üzerine yerleştirin, daha önce olduğu gibi vakum uygulayın ve her bir oyuğa 200 μL 1x yıkama tamponu ekleyin.
- Tahlil plakası kuyucuklarının içeriğini vakumlu filtrasyon ile çıkarın. Plakanın altındaki fazla yıkama tamponunu emici bir ped veya kağıt havluyla kurulayın. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
not: Test bir V-tabanlı mikroplaka veya mikro FACS tüpleri kullanılarak gerçekleştirilirse, 1.12 ve 1.13 adımlarını atlayın. Bunun yerine, plakayı oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyin, ardından çok kanallı bir pipet kullanarak süpernatanı çıkarın.
- Her oyuğa 25 μL tespit antikoru ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Plakayı yeni bir tabak kapatıcı ile kapatın. Ters çevrilmiş plaka kapağı da dahil olmak üzere tüm plakayı alüminyum folyo ile sarın.
- Plakayı bir plaka çalkalayıcıya yerleştirin ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca yaklaşık 500 rpm'de çalkalayın.
- Vakumlamadan, her bir oyuğa doğrudan 25 μL streptavidin-fikoeritrin (SA-PE) reaktifi ekleyin. Reaktifin seyreltilmesi gerekli değildir.
- Plakayı yeni bir tabak kapatıcı ile kapatın. Ters çevrilmiş plaka kapağı da dahil olmak üzere tüm plakayı alüminyum folyo ile sarın.
- Plakayı bir plaka çalkalayıcıya yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yaklaşık 500 rpm'de çalkalayın.
- Yukarıdaki 1.13 adımını tekrarlayın.
- Her kuyucuğa 200 μL 1x Yıkama Tamponu ekleyin. Boncukları bir plaka çalkalayıcı üzerinde 1 dakika tekrar askıya alın.
- Çok kanallı bir pipet kullanarak, numuneleri bir akış sitometresinde okumak için numune plakasından FACS tüplerine aktarın.
not: Numunenin kuru çalışmasını önlemek için her tüpe fazladan 100 μL 1x Yıkama Tamponu eklenerek numune hacmi 200 μL'den 300 μL'ye çıkarılabilir. Gerekirse, numuneler 4 °C'de saklanabilir, ışıktan korunabilir ve ertesi gün analiz edilebilir. Bununla birlikte, numunenin uzun süre saklanması, sinyalin azalmasına neden olabilir.