Method Article

Beyin Dokusundaki Anormal Prion Proteinlerinin İmmünohistokimya Kullanılarak Saptanması

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaynak: Orge, L., et al. Anormal Prion Proteininin İmmünohistokimya ile Saptanması. J. Vis. Uzm. (2023).

Bu videoda, immünohistokimya kullanılarak beyin kesitlerinde yanlış katlanmış prion proteinini tespit etmek için kullanılan bir teknik gösterilmektedir. Prionları denatüre etmek ve enfeksiyon riskini en aza indirmek için beyin bölümünün formik asit ile muamele edilmesinin yanı sıra ısıya bağlı epitop alımı kullanılarak prion agregatlarının maskesi çıkarıldıktan sonra, kesitler yanlış katlanmış prion protein agregatları için immüno-etiketlenir ve mikroskop altında gözlemlenir.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Doku kesitleme ve lam hazırlama

  1. Formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü (FFPE) dokuların bölümlerini bir mikrotom kullanarak 3-5 μm kalınlığında kesin.
  2. Bölümleri, kullanılan parafinin erime noktasının yaklaşık 10 °C altında bir sıcaklıkta arıtılmış su üzerine yüzdürün. Sudaki bölümleri özel olarak işlenmiş mikroskop slaytlarının üzerine kaldırın (Malzeme Tablosuna bakın). Suyun kaydıraklardan iyice akmasına izin verin.
  3. Dokuların kayma yapışmasını artırmak için slaytları gece boyunca 50 °C'de inkübe edin.
    not: IHC protokolleri için taze kesitli dokuların hazırlanması tercih edi....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Mutlak etanolLabchem (Laboratuvar KimyasallarıLB0507-9010Sulandırılmamış
            Damıtılmış suda %90, %70 ve %50 seyreltilmiş
Avidin-biotin kompleksi ve peroksidaz
Vectastain Elite ABC kiti Peroksidaz
Vektör LaboratuvarlarıPK-6100Kullanmadan 30 dakika önce kit talimatlarına göre hazırlayın ve hafifçe karıştırın. Ayakta durduktan sonra karıştırmayın.
Biyotinile edilmiş ikincil antikor (At anti-fare IgG H+L)Vektör LaboratuvarlarıBA-2000-1.5TBS'de 1/200 oranında% 10 at normal serumu ile seyreltin. Bölüm sayısına bağlı olarak gereken hacmi hazırlayın.
Kromojen Diaminobenzidin-DAB, substrat kiti, PeroksidazVektör LaboratuvarlarıSK-4100Kullanmadan önce kit talimatlarına göre hazırlayın.
Bölüm başına 400 μL çözelti kullanın.
DakoCytomation Pascal basınç odasıDAKOS2800 Serisi
Ehrlich'in Hematoksilini:
Mutlak etanolLabchem (Laboratuvar KimyasallarıLB0507-9010
Buzlu asetik asitMerck101830 Haber Kaynağı
Potasyum şapMerck1.01047.1000
GliserinMerck1.04091.1000
Endojen Peroksidaz Blok çözeltisi (% 3 konsantrasyon H2O2):360 mL Metanol içinde 40 mL Hidrojen peroksit (%30 a/a).
Kullanmadan önce hazırlayın
Hidrojen peroksit (%30 a/a)Scharlau BelediyesiHI0136
metanolSigma Aldrich322415-2L
Formik asit %98Merck1.00264.1000Sulandırılmamış
MikrotomŞandon-AS325MikrotomŞandon-AS325
TBS'de normal serum (% 20) blok çözeltisi:
At normal serumu
Gibco (Gibco)16050-122Tahlildeki bölüm sayısına göre son cildi hazırlayın
(bölüm başına 200 μL çözelti).
Birincil antikor anti-PrP Fare MAb 2G11BİYORADMCA2460PrP 146-R154R171182
Atipik scrapie, cervine, kedi dahil olmak üzere küçükbaş. Bovine.
için uygun değil Testteki bölüm sayısına (bölüm başına 200 μL çözelti) ve antikor seyreltmesine göre, ikincil antikorun yükseltildiği türden (at normal serumu)
Olağan antikor seyreltmesi: MAb 2G11 1/100, ancak en düşük arka plana sahip en güçlü etiketlemeyi verecek konsantrasyonu elde etmek için her yeni partide çalışma seyreltmesi oluşturulmalıdır. Depolama için, en az 10 μL'lik alikot hacimlerini steril mikrotüplere dondurun. Buzunu çözün ve her seferinde bir alikot kullanın.
Birincil antikor anti-PrP Fare MAb 12F10Cayman Kimya Şirketi189710PrP142-160
Sığır, küçükbaş
için uygun değil Olağan antikor seyreltmesi: 1/200, ancak çalışma seyreltmesi de oluşturulmalıdır. MAb 2G11 olarak hazırlayın
Shandon CoverplateTM haznesiTermo Bilimsel72110017
Shandon Sequenza® Bağışıklık boyama merkeziTermo Bilimsel73300001
Shandon Sequenza® Immunstaining sürgülü rafTermo Bilimsel73310017
Çözelti Sitrat Tamponu (10 mM pH 6.1):Bir litre arıtılmış suda 2.55 g Tri-sodyum sitrat dihidrat ve 0.255 g Sitrik asit.
10 mM sitrik asit çözeltisi (500 mL arıtılmış suda 1,05 g sitrik asit) kullanarak çalışma çözeltisinin pH'ını 6,1'e ayarlayın
Tahlil gününde hazırlanın.
Tri-sodyum sitrat dihidratSigma-aldrichS4641-500G
Sitrik asitSigma AldrichC0759
Boyama kavanozu ve sepetiDelta Laboratuvarı19360
19361
Superfrost Plus mikroskop slaytlarıVWR (VWR)631-0108
Tris-Tamponlu Tuzlu Su Çözeltisi (TBS) (50 mM TRIZMA BAZI; %0.8 NaCI; pH 7.6):10xTBS (stok çözelti 0.5 M TRIZMA BAZI;% 8 NaCI; pH 7.6):
TRIZMA BASE 60,57 g ve NaCl 800 g 800 mL arıtılmış su içinde. Hidroklorik asit %37 kullanarak stok çözeltinin pH'ını ve nihai hacmi arıtılmış su ile bir litreye ayarlayın (2 aya kadar 5±3 °C tutun)
Tahlil gününde TBS stok çözeltisini 1/10 oranında seyreltin.
TRIZMA ÜSSÜSigma AldrichT6066-1KG
Sodyum Klorür (NaCl)Merck106404
KsilenPanreac Uygulamalı Kimyasal ITW reaktifleri251769Sulandırılmamış
) Serisi Serisi Serisi ) Serisi Serisi · · Serisi ·

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Prion Protein DetectionImmunohistochemistryFormic Acid TreatmentHeat Induced Epitope RetrievalEndogenous Peroxidase InactivationPrimary Antibody BindingBiotinylated Secondary AntibodyAvidin Biotin ComplexChromogenic SubstrateMicroscopic Observation

Related Articles