$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Doku kesitleme ve lam hazırlama
- Formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü (FFPE) dokuların bölümlerini bir mikrotom kullanarak 3-5 μm kalınlığında kesin.
- Bölümleri, kullanılan parafinin erime noktasının yaklaşık 10 °C altında bir sıcaklıkta arıtılmış su üzerine yüzdürün. Sudaki bölümleri özel olarak işlenmiş mikroskop slaytlarının üzerine kaldırın (Malzeme Tablosuna bakın). Suyun kaydıraklardan iyice akmasına izin verin.
- Dokuların kayma yapışmasını artırmak için slaytları gece boyunca 50 °C'de inkübe edin.
not: IHC protokolleri için taze kesitli dokuların hazırlanması tercih edilir, ancak TSE pozitif ve negatif kontrol bölümleri önceden hazırlanabilir ve saklanabilir. 2'den 4'e kadar olan adımlar kimyasal çeker ocakta gerçekleştirilmelidir.
2. Deparafinizasyon ve rehidrasyon
- Slaytları doku bölümleriyle birlikte paslanmaz çelik bir boyama sepetine yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu). Sepeti 3 dakika boyunca bir ksilen banyosuna (paslanmaz çelik boyama kabı) daldırın, çıkarın ve bir kez daha daldırın.
- Ksilen ve bölümleri 3 dakika boyunca mutlak bir etanol banyosuna batırarak çıkarın.
- Bölümleri havayla kurutun ve 1 dakika boyunca %90 etanol banyosuna koyun. Bir dakika daha %70 etanol banyosuna aktarın, ardından 1 dakika boyunca %50 etanol banyosuna son bir transfer yapın. Her etanol banyosu işlemi için, sürgülü sepeti iki kez hafifçe çalkalayın ve bir sonraki aktarımdan önce sepeti boşaltın.
3. Epitop alma
- Doku bölümlerini oda sıcaklığında 30 dakika boyunca dikkatlice %98 formik aside daldırın. Bölümleri musluk suyunda 5 dakika durulayın, ardından damıtılmış suda iki kez durulayın.
Dikkat: Formik asit oldukça aşındırıcıdır. Koruyucu gözlük ve eldiven giyilmelidir.
- Aşağıdaki adımları izleyerek Isıya Bağlı Antijen Alımı (HIER) gerçekleştirin.
not: Bu adım, belirli bir basınç odasında 30 dakika boyunca 121 °C'de hidratlı otoklavlama ile gerçekleştirilir (bkz. Malzeme Tablosu).
- Sitrat tamponunu (10 mM, pH 6.1, Malzeme Tablosuna bakınız) 98 °C'de yaklaşık 20 dakika boyunca 500 mL damıtılmış su ile doldurulmuş basınç odasının içine yerleştirilmiş paslanmaz çelik bir boyama kabında önceden ısıtın.
not: Bu çalışma için, kullanılan belirli ekipman için program Ayar Noktası 1 (SP1) idi.
- Alarm, ekipmanın programlanan süre ve sıcaklığa ulaştığını gösterdikten sonra, sepeti kızaklarla daldırın ve programı Ayar Noktası 2'ye (121 dakika boyunca 30°C) başlatın. Kalite kontrol amacıyla, sıcaklık ve basıncı izlemek için sepete yapışkan otoklav gösterge bandının bir bölümünü yerleştirin ve bu programın ilk ve son basıncını kaydedin.
- İmmün boyanacak slayt sayısı sepetin kapasitesine ulaşmazsa, boş pozisyonları işgal etmek için temiz, boş slaytlar kullanın. Program sona erdikten sonra, odanın ortam basıncına pasif olarak geri dönmesine izin verin (en az 30 dakika).
not: Daha uzun süreler, spesifik olmayan arka plan lekelenmesini azaltabilir.
- Sürgülü sepeti 5 dakika boyunca damıtılmış suyla doldurulmuş paslanmaz çelik bir boyama kabına dikkatlice aktarın.
4. Endojen peroksidazın inaktivasyonu
- Numune bölümlerini içeren sürgülü sepeti 30 dakika boyunca metanol içinde %3 hidrojen peroksit (H2O2) içeren bir banyoya daldırın. Bölümleri akan su altında durulayın (5 dakika). Bölümleri boşaltın ve 1x Tris tamponlu tuzlu suya (TBS) 5 dakika daha daldırın.
5. İmmün algılama
NOT: Bu çalışma için, immüno-algılama, ticari olarak temin edilebilen bir kayar klips montaj sistemi kullanılarak kılcal boşluk formatı kullanılarak gerçekleştirilmiştir (bkz. Diğer immünohistokimya slayt sistemleri de uygulanabilir.
- Her bir slaytı, TBS ile önceden nemlendirilmiş, ticari olarak temin edilebilen bir kapak plakası tutucusuna (Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin, kabarcıklardan kaçının, doku tarafı tutucuya bakacak ve kayar kenarlar tutucunun iki alt noktasına denk gelecek şekilde yerleştirin.
- Sürgülü tutucu tertibatını başparmak ve işaret parmağı arasında, bir parmağınız numune slaytının üstünde ve diğer parmağınız tutucunun altında olacak şekilde tutun. Ardından, montajı sistemin galerisine yerleştirin.
- Setin iyi bir şekilde monte edildiğinden emin olmak için, numune lamı ile tutucu arasındaki kuyuyu hemen taşmaması gereken TBS ile doldurun. Bu noktadan itibaren, tutucu ile sürgü arasında yaklaşık 80 μL TBS tutulması gerektiğinden emin olun. Bölümlerin kurumasına izin vermeyin.
- Sisteme girdikten sonra, primer antikor (prion proteinlerine karşı antikor (anti-PrP), bakınız Malzeme Tablosu) ile tedaviden önce arka plan lekelenmesini azaltmak için, numune slaytlarını, TBS'de 30 dakika boyunca immün boyama için kullanılan ikincil antikor konakçısı ile aynı türden% 20 normal serum ile önceden inkübe edin (mevcut durumda, at serumu).
- Analiz edilen hayvan türüne göre kullanılacak antikor alikotlarının sayısını, incelenecek numune bölümlerinin sayısını ve çalışma seyreltme miktarını çözün.
not: En iyi sonuçlar için, ikincil antikor ve birincil antikor çözeltilerinin kaynağı ile aynı türden% 10 normal serum kullanın. Mümkünse, en iyi sonuçlar için, normal serumun ve ikincil antikorun konak kaynağı aynı türden olmalıdır.
- Bölümleri yıkamadan, birincil antikor çözeltisini doğrudan (200 μL) kayar tutucu setinin her bir oyuğuna uygulayın ve oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edin.
- Yıkamak için sürgü tutucu setlerin kuyularını TBS ile doldurun ve 5 dakika bekleyin. İki kez tekrarlayın.
- Biyotinile edilmiş ikincil antikoru (monoklonal anti-murin Horse Ab, bkz. Malzeme Tablosu) TBS'de 1/200 oranında% 10 at serumu ile seyreltin. Tedavi edilecek bölüm sayısına bağlı olarak gerekli hacmi hazırlayın.
- İkincil antikor çözeltisini (200 μL) kayar tutucu setinin her bir oyuğuna uygulayın. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- Adım 5.5'te anlatıldığı gibi yıkayın.
- Avidin-biotin kompleksi peroksidaz (ABC/HRP kompleksi, bkz. Malzeme Tablosu) ile inkübasyon için, reaktifi kullanmadan 30 dakika önce hazırlayın. ABC/HRP kompleks çözeltisini (200 μL) kayar plaka tutucu setinin her bir oyuğuna uygulayın. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- Adım 5.5'te anlatıldığı gibi yıkayın.
>6. 3,3' diaminobenzidin (DAB) kromojeni ile geliştirme
DİKKAT: DAB potansiyel bir kanserojendir. Sonuç olarak, bu reaktifle çalışırken göz koruması, laboratuvar önlükleri, eldivenler ve iyi laboratuvar prosedürleri dahil olmak üzere uygun özen gereklidir. Yerel yönetmeliklere uygun olarak atın.
- Kullanmadan hemen önce kromojeni üreticinin talimatlarına göre seyreltin (Malzeme Tablosuna bakın). Kromojen çözeltisini (400 μL) kayar plaka setinin her bir oyuğuna uygulayın.
- Oda sıcaklığında 30 dakikaya kadar inkübe edin. PrPSc (prion proteinlerinin anormal izoformu) pozitif kesitlerde genellikle 10 dakikalık bir inkübasyon süresi yeterlidir.
- Slaytları damıtılmış suda yıkayarak kalan kromojen çözeltisini çıkarın. Slaytları kapak plakası tutucularından çıkarın ve damıtılmış su içeren plastik bir kaba koyun.