1. İmmünojenlerin Hazırlanması
- Her bir siyanobakteri suşu, Tablo 1'de açıklanan koşullar altında karşılık gelen kültür ortamında büyütün.
NOT: Her bir siyanobakteri suşu için büyüme ortamı ve kültür koşulları Tablo 1'de listelenmiştir. K17 hariç tüm siyanobakteri suşları, Autonoma Üniversitesi'nden (Madrid, İspanya) Antonio Quesada'nın grubuna aittir. Planktothrix rubescens'e karşı antikor, Vilasouto rezervuarından (kuzey İspanya) bu siyanobakterinin monospesifik çiçeklenmesinin doğal bir örneğinden üretildi.
- Geç üstel veya durağan bir büyüme fazı kültüründen yaklaşık 108 hücre / mL elde etmek için optik mikroskopi ile bir hücre sayma odası kullanarak hücre sayısını ölçün.
- 5 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüjleme ile 5 mL kültürden hücreleri hasat edin.
- Süpernatanı atın ve hücreleri 5 mL 1x fosfat tamponlu salin (1x PBS) ile 10 mL'lik bir tüpte yeniden süspanse edin ve yaklaşık 108 hücre / mL elde edin.
- Süspansiyonun hücrelerini, her biri 30 saniye olmak üzere 5 döngü boyunca sonikasyon ile homojenize edin ve parçalayın, buz üzerinde 30 ila 60 saniyelik bir duraklama ile, taşınabilir, elde tutulan bir ultrasonik işlemci kullanarak veya tüpü maksimum genlikte (30 kHz) bir hücre bozucunun su banyosuna daldırarak.
- Her bir siyanobakteri suşu için 1.3 - 1.5 arasındaki adımları tekrarlayın.
NOT: Sonikasyon, hücre bozulması ve hücresel içerik salınımı üretir. Proteinler ve polisakkaritler iyi immünojenler olsa da, lipitler ve nükleik asitler gibi spesifik moleküller kendi başlarına humoral immünojenik bir yanıtı indüklemezler. Bu nedenle, moleküler karmaşıklığı artırmak için polisakkaritler veya proteinler gibi taşıyıcılara bağlanmaları gerekir. Ek olarak, sonikasyon, antikor üretimini tetikleyebilen hücre içi materyali serbest bırakır.
2. Poliklonal Antikorların Üretimi
- İlk immünojen dozunu, adım 1.5'te elde edilen ultrasoniklenmiş hücre lizatının 0.5 mL'sini tam Freund'un adjuvanı ile 0.5 mL karıştırarak hazırlayın. Poliklonal tavşan antikoru üretimi için bir hayvan tesisinin operatörüne teslim edin.
- Adım 1.5'te elde edilen aynı homojenat / lizatın 0.5 mL'sini 0.5 mL eksik Freund adjuvanı ile karıştırarak antikor üretim sürecinde hafıza artırıcıları olarak daha fazla kullanım için daha önce olduğu gibi üç doz daha hazırlayın. Antikor üretim sürecini yerine getirmek için onları hayvan tesisine verin.
- Her yeni antikor üretim prosesi için 2.1 ve 2.2 adımlarını tekrarlayın.
NOT: Normalde, antikor üretimi özel hayvan tesislerine veya şirketlerine emanet edilir, çünkü hayvanlarla çalışmak için uygun lisanslama ve eğitim gereklidir. Şirketler, serum örneğinde bulunan antijene özgü antikorların miktarının nispi bir enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ölçümü sağlar.
3. Antikor Saflaştırması
- Protein-A afinite kromatografisi ile adım 2'de toplanan immünoglobulin G (IgG) fraksiyonunu hem immün hem de pre-immün serumdan saflaştırın. Kartuş sistemlerine dayalı bazı ticari arıtma kitleri iyi çalışır; Sağlayıcı talimatlarını izleyin.
- Saflaştırma kiti bir tuzdan arındırma sistemi sağlamadığında, saflaştırılmış antikorların elüsyonundan sonra tamponu, diyaliz yoluyla veya 100 kDa (veya daha düşük) membran gözenek boyutuna sahip santrifüj filtre cihazları kullanarak 0.1x PBS'ye değiştirin.
- 280 nm'de absorbansı ölçerek veya Bradford, Lowry veya Biskinconinik asit (BCA) gibi kolorimetrik yöntemler kullanarak antikor konsantrasyonunu belirleyin.
NOT: Elüsyon tamponuna (örneğin, Tris tamponları) amin gruplarının dahil edilmesinden kaçınmak önemlidir, çünkü bunlar epoksi grupları ile aktive edilmiş katı yüzeylere bağlanmak için antikorla rekabet eder. Saflaştırmadan sonra, antikor aktivitesini ELISA ile test etmek önemlidir.
4. Floresan Antikor Etiketleme
- Bölüm 3'te elde edilen saflaştırılmış antikorları, 1 mg proteini 100 μL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde etiketlemek için boya içeren ticari bir şişeyi çözerek bir florokrom (örneğin, uzak kırmızı bir floresan boya) ile etiketleyin. 50 mM fosfat tamponlu salin (pH 8.5) içinde 50 μL'lik bir son hacimde 2 mg / mL konsantrasyonda her bir antikor preparatına 2 μL çözünmüş boya ekleyin.
- Etiketleme reaksiyonlarını ortam sıcaklığında 1 saat ve titreşimli bir platform üzerinde 1.200 rpm boyunca sürekli çalkalama altında tutun.
- Etiketli antikorları, tedarikçi tavsiyelerini izleyerek boyut dışlama kromatografisi ile (örneğin, bir kolona hapsolmuş 1.5 ila 30 kDa arasında bir fraksiyonasyon aralığına sahip bir jel kullanarak) saflaştırın.
- Elüatlarda 280 nm ve 650 nm'de absorbansı ölçün ve tedarikçi tavsiyelerine göre etiketleme verimliliklerini hesaplayın.
NOT: 1 mg proteini etiketlemek için tek bir floresan boya şişesi ile 50 x 50 μL'ye kadar antikor etiketleme reaksiyonu yapılabilir. Tüplerin alüminyum folyo ile kaplanması veya alternatif olarak, adım 4.3'ten sonra su verme işlemlerinden kaçınmak için opak 0,5 mL'lik tüplerin kullanılması önerilir. IgG antikorları için, antikor mol başına 3-7 mol boya ile optimal etiketleme elde edilir.
5. SİYANOP Üretimi
- Baskı çözeltisindeki antikorlar ve kontroller
- Her bir antikoru 1 mg / mL'de ticari bir 1x protein baskı tamponunda %0.01 (h/h) Tween 20 (iyonik olmayan bir deterjan) ile karıştırarak baskı çözeltisinde her saflaştırılmış antikorun 30 μL'sini hazırlayın, tümü nihai konsantrasyonlar olarak.
NOT: Alternatif olarak, bir antikor çözeltisi karbonat tamponunda (pH 8.5) %20 gliserol, %1 (a/h) sükroz (veya koruyucu olarak trehaloz) ve %0.01 (h/h) Tween 20 içerebilir.
- Kontrol olarak 30 μL baskı çözeltisi hazırlayın: (a)% 0.01 (v / h) Tween 20 ile 1x protein baskı tamponu, (b) % 0.01 (v / h) Tween 20 ile 1x protein baskı tamponunda 1 mg / mL'de protein-A saflaştırılmış ön bağışıklık serumu ve (c) sığır serum albümini (BSA)% 0.01 (h / h) Tween 20 ile 1x protein baskı tamponunda 1 mg / mL'de.
- Farklı konsantrasyonlarda (örn., 50 μg / mL ila 1 μg / mL) 30 μL floresan etiketli, saflaştırılmış bir pre-immün serum hazırlayın, adım 5.1.1'deki gibi Tween 20 ile 1x protein baskı tamponunda. Bu numuneler, floresan çerçeve işaretleyicileri olarak ve lekelenmeden sonra nispi floresan miktar tayini için kullanılacaktır.
- 5.1.1, 5.1.2 ve 5.1.3 adımlarında hazırlanan baskı solüsyonlarının her bir oyuğuna 30 μL'yi, polipropilen gibi mikrodizi üretimi için en yüksek kaliteli 384 oyuklu mikroplakalara ekleyin.
NOT: Protein baskı tamponu, antikorların kalitesini ve stabilitesini arttırır ve Tween 20, nokta morfolojisini homojenleştirir ve protein eşleşmesini oluşturur. 384 oyuklu mikroplakanın kullanımdan önce 4 °C'de tutulması tavsiye edilir. -20 °C'de uzun süre saklayın. Polipropilen düşük DNA, protein, hücre özü ve küçük moleküllü içsel bağlanmaya sahiptir.
- Mikroskop lamı üzerine antikor baskısı
NOT: Temaslı, ayrık iğneli veya piezoelektrik yazıcılar veya "mürekkep püskürtmeli" teknolojiler gibi temassız cihazlar gibi farklı dizi platformları kullanarak antikorları aktif mikroskop slaytlarına yazdırın. Bu çalışmada, CYANOCHIP, μm ölçeğinde antikorların nL miktarlarını tespit edebilen bir robotik sistem (arrayer) kullanılarak temas yoluyla rutin olarak basılmıştır.
- Baskı odasının ortam koşullarını 20 °C ve %40 - 50 bağıl neme ayarlayın.
- Her slaytta birkaç özdeş antikor dizisi gerçekleştirmek için slayt alt tabakalarını (örneğin, 75 x 25 mm epoksiyle aktive edilmiş mikroskop cam slaytları) ayarlayın.
- Kontroller ve referans çerçevesi de dahil olmak üzere her saflaştırılmış antikoru üçlü bir nokta modelinde tespit edin; Bu koşullar altında, noktaların çapı 180 - 200 μm'dir.
- Yazdırdıktan sonra, slaytları kuruması için ortam sıcaklığında en az 30 dakika bekletin ve ardından 4 °C'de saklayın; Sahada çalışmak için, slaytlar birkaç ay boyunca ortam sıcaklığında taşınabilir ve saklanabilir.
NOT: CYANOCHIP, slayt başına 3 x 8 aynı mikrodizi veya 1 x 9 mikrodizi formatında 9 özdeş dizi ile üçlü spot mikrodizi formatında yazdırılır. Her dizi boyutu, 24 oyuklu bir conta için reaksiyon odası boyutlarından daha yüksek olmamalıdır (genellikle 3 x 8 hibridizasyon odasında 7,5 x 6,5 mm).
- Çevresel numuneleri analiz etmek için mikrodiziyi kullanmadan önce, bir titrasyon eğrisindeki her bir antikor için çalışma seyreltmesini belirlemek için floresan sandviç mikrodizi immünolojik test (FSMI) kullanın. Her antikor için, karşılık gelen immünojenin standart bir konsantrasyonunu (103 - 104 hücre / mL) ve floresan antikorun seri dilüsyonlarını (1:500 ila 1:32.000 arasında) kullanın. Optimal antikor konsantrasyonu, titrasyon eğrisinde elde edilen maksimum sinyal yoğunluğunun %50'sine karşılık gelir. Ayrıca, her bir antikor için duyarlılık ve özgüllük, Blanco ve ark.'da tarif edildiği gibi belirlenmelidir.
6. Floresan Sandviç Mikroarray İmmünoassay (FSMI) için Çevresel Multianalit Ekstraktlarının Hazırlanması
- Sıvı bir numuneden multianalit özütü
- Steril bir şırınga ile 1 - 100 mL sıvı numune alın (örneğin, bir su rezervuarının kıyısından gelen su); numune miktarı büyük ölçüde hedeflerin potansiyel konsantrasyonuna bağlıdır.
- Su örneğini 3 μm gözenek boyutu, 47 mm çapında polikarbonat filtreden geçirerek hücreleri konsantre edin; pozitif tespit için 103 - 108 hücre / mL arasında bir hücresel konsantrasyon arzu edilir, ancak gerçek konsantrasyon bilinmemektedir.
- Filtrede toplanan biyokütleyi 1 mL modifiye Tris tamponlu salin, Tween 20 takviyeli tampon (TBSTRR; 0.4 M Tris-HCl (pH 8), 0.3 M NaCl ve %0.1 Tween 20) ile bir spatula ile 15 mL'lik bir tüpe kazıyarak geri kazanın.
- Adım 1.5'te tarif edildiği gibi elde tutulan bir ultrasonik işlemci kullanarak veya sadece birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek homojenize edin ve ayrıştırın; Bu, numuneyi mikrodizi tarafından analiz için hazırlar.
- Katı bir numuneden multianalit ekstraktı
- 0,5 g'a kadar katı numuneyi (örn., kaya, toprak veya tortular) 10 mL'lik bir tüpe tartın ve 2 mL'ye kadar TBSTRR ekleyin.
- Sonikatör probunu tüpe daldırarak, tüpü güçlü bir sonicator boynuzunun su banyosuna daldırarak veya elde tutulan bir sonicator kullanarak sonikat yapın. 5 kHz'de en az 30 x 30 sn döngü gerçekleştirin, buz üzerindeyken 30 saniye durun.
- 10 ila 12 mm çapında, 5 ila 20 μm gözenek boyutunda naylon filtre tutucuya bağlı 10 mL'lik bir şırınga ile kum, kil ve diğer kaba malzemeleri çıkarmak için filtreleyin. Numuneyi filtreden 1,5 mL'lik bir tüpe itin. Filtre doyurulursa, şırıngadaki süspansiyonu çalkalayın ve yenisine alın; Bu, süzüntü materyalini immünolojik test için hazırlar (adım 7).
NOT: TBSTRR'nin tamponlama kapasitesi numunenin türüne bağlıdır. Enzimatik bozunmanın analitler üzerindeki etkisini önlemek için çevresel ekstraktın hazırlanmasından hemen sonra immünolojik testin yapılması önemlidir. Alternatif olarak, çevresel ekstrakta proteaz inhibitörleri ekleyin ve bir sonraki adıma kadar -80 °C'de dondurun.
>7. Floresan Sandviç Mikrodizi İmmünoassay (FSMI)
- CYANOCHIP
bloke etme
NOT: Kullanmadan hemen önce, basılı slaytları, slayt üzerindeki tüm serbest epoksi gruplarını bloke etmek ve kovalent olarak bağlı olmayan antikorların fazlalığını gidermek için işlemden geçirin.
- Mikrodiziyi, temiz bir yüzeyde (örneğin, Petri kabı veya 50 mL'lik bir tüp) %5 (a/h) BSA çözeltisi ile 0,5 M Tris-HCl'ye (pH 9) daldırın ve 5 dakika boyunca bir külbütör platformundan hafif çalkalama ile Alternatif olarak, slaytı, mikrodizi noktaları ona bakacak şekilde yukarıdaki çözeltinin 100 ila 200 μL'lik bir damlasına yerleştirin. 3-5 dakika bekletin ve sonra devam edin.
- Plastik uçlu forseps kullanarak slaytı dikkatlice alın; mikroarray bölgelerine dokunmaktan kaçının. Slaytı bir kağıt havluya yumuşak bir şekilde vurarak fazla sıvıyı ortadan kaldırın. Bir külbütör platformundan hafif çalkalama ile 30 dakika boyunca% 2 (a / h) BSA çözeltisi ile 0,5 M Tris-HCl (pH 8) içine daldırın.
- Mikroskop slaytları için uyarlanmış ticari bir mikrosantrifüj kullanarak kısa bir santrifüjleme (1 dakika boyunca 200 - 300 x g) yaparak slaydı kurutun. Alternatif olarak, bir kağıt havluya yumuşak bir şekilde vurarak slaytı kurulayın.
- Multianalit numune ekstraktının mikroarray ile inkübasyonu
- Slaytı, birden fazla mikrodizi için 24 kuyucuklu ticari bir mikrodizi hibridizasyon kasetine yerleştirin; sağlayıcı talimatlarını izleyin.
- Slayt ve kaset montajından sonra, kasetin her bir oyuğuna 50 μL'ye kadar numune ekstraktını pipetleyin veya TBSTRR'de seyreltin.
- Analiz edilecek her numune için 7.2.2 adımını tekrarlayın.
- Boş kontrol olarak, 50 μL TBSTRR tamponunu kasetin en az iki ayrı kuyucuğuna pipetleyin.
- Her 15 dakikada bir pipetleyerek veya hafif çalkalayarak karıştırarak 1 saat ortam sıcaklığında inkübe edin. Alternatif olarak, 4 °C'de 12 saat inkübe edin.
NOT: Mikrodizi modelinin bir fonksiyonu olarak diğer inkübasyon contalarını kullanın. Adım 7.2.5'teki inkübasyonun süresi ve sıcaklığı, normalde her bir eşleştirilmiş antijen-antikorun afiniteye ve bağlanma kinetiğine bağlı olan ampirik parametrelerdir.
- yıkama
- Kaseti yere koyarak ve temiz, emici bir kağıda dikkatlice vurarak örnekleri çıkarın.
- Her birine 150 μL TBSTRR ekleyerek kuyuları yıkayın ve yukarıdaki gibi tamponu ortadan kaldırın.
- Adım 7.3.2'yi üç kez daha tekrarlayın.
- Floresan dedektör antikorları ile inkübasyon
- Her biri %1 (a/a) BSA ile TBSTRR'de florokrom ile etiketlenmiş 17 anti-siyanobakteriyel suş antikoru içeren 50 μL antikor karışımı ekleyin. Her bir antijen/antikor çiftinin titrasyon deneylerini gerçekleştirerek karışımdaki her bir floresan antikorun konsantrasyonunu (0,7 ila 2 μg/mL) belirleyin.
- Adım 7.2.5'te açıklandığı gibi ortam sıcaklığında 1 saat veya 4 °C'de 12 saat inkübe edin.
- Floresan antikorların yıkanması
- Adım 7.3'teki gibi floresan bağlanmamış antikorları çıkarın.
- Kaseti sökün ve hızlı bir durulama için slaytı 0.1x PBS'ye (örn. 50 mL'lik bir tüpe) daldırın.
- Sürgüyü adım 7.1.3'teki gibi kurutun.
8. Floresan taraması
- Floresan için bir tarayıcıda uzak kırmızı floresan boya için maksimum emisyon floresan tepe noktasında slaydı floresan için tarayın. Genellikle lazer kazanç değerini düşürerek, farklı tarama parametrelerinde mikrodizilerin birkaç görüntüsünü alın.
not: Doymuş noktalardan kaçının (> 65.000 floresan sayımı) - bunlar ölçek dışıdır ve niceleme hatalarına neden olabilir.
Tablo 1. CYANOCHIP'i üretmek için kullanılan antikorların (Abs) ve siyanobakteri suşlarının listesi.
Teknolojisi
Teknolojisi
Teknolojisi
Teknolojisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
| Ab kodu | İmmünojen (suş) | sipariş | habitat | Orta | Kültür koşulları |
| K1 | Anabaena sp. | Nostocales (Nostocales) | bilinmeyen | BG11 ve nitrat | 30 ºC, sürekli ışık |
| K2 | Anabaena sp. | Nostocales (Nostocales) | bilinmeyen | BG11o | 30 ºC, sürekli ışık |
| K3 | Microcystis flosaquae | Akciğer Mantarı | planktonik | BG11 | 28 ºC, sürekli ışık |
| K4 | Microcystis novacekii | Akciğer Mantarı | planktonik | BG11 | 28 ºC, sürekli ışık |
| K5 | Microcystis aeruginosa | Akciğer Mantarı | planktonik | BG11 | 28 ºC, sürekli ışık |
| K6 | Aphanizomenon ovalisporum | Nostocales (Nostocales) | planktonik | BG11o | 28 ºC, sürekli ışık |
| K7 | Phormidium sp. | Oscillatoriales | bentik | BG11 | 18 ºC, 16-8 fotoperiyot |
| K8 | Rivularia sp. | Nostocales (Nostocales) | bentik | CHU-D | 18 ºC, 16-8 fotoperiyot |
| K9 | Chamaesiphon sp. | Akciğer Mantarı | bentik | BG11 | 18 ºC, 16-8 fotoperiyot |
| K10 | Leptolyngbya boryana | Oscillatoriales | bentik | BG11 | 18 ºC, 16-8 fotoperiyot |
| K11 | Tolypothrix distorta | Nostocales (Nostocales) | bentik | BG11o | 18 ºC, 16-8 fotoperiyot |
| K12 | Aphanizomenon aphanizomenoides | Nostocales (Nostocales) | planktonik | BG11o | 28 ºC, sürekli ışık |
| K13 | Nostoc sp. (Antarktika) | Nostocales (Nostocales) | bentik | BG11o | 13 ºC, 16-8 fotoperiyot |
| K14 | Anabaena sp. | Nostocales (Nostocales) | bentik | BG11o | 13 ºC, 16-8 fotoperiyot |
| K15 | Leptolyngbya sp. | Oscillatoriales | bentik | BG11 | 13 ºC, 16-8 fotoperiyot |
| K16 | Tolypothrix sp. | Nostocales (Nostocales) | bentik | BG11 | 13 ºC, 16-8 fotoperiyot |
| K17 | Planktothrix rubescens | Oscillatoriales | planktonik | hiç kimse | hiç kimse |