3D hidrojel sisteminde kapsüllenmiş hücrelerin immün boyalanması

Özet

Kaynak: LeSavage, B. L., et al. 3D'de Hücrelerin Kapsüllenmesi ve İmmün Boyanması için Elastin Benzeri Protein Hidrojellerinin Üretimi.

Bu videoda, bir 3D hidrojel içinde kapsüllenmiş hücrelerin immün boyama tekniği gösterilmektedir. Nöral progenitör hücreleri içeren hidrojel kültürü sabitlenir, geçirgen hale getirilir ve spesifik olmayan immün boyamayı önlemek için bir bloke edici çözelti ile muamele edilir. Spesifik proteinleri bağlamak için bir birincil antikor kokteyli eklenir, ardından floresan olarak etiketlenmiş ikincil antikorlar ve bir nükleer leke eklenir. Numune daha sonra bir lam üzerine monte edilir ve konfokal bir mikroskop altında gözlemlenir.

Protokol

1. 3D Elastin Benzeri Protein (ELP) Hidrojellerinde Hücre Kapsülleme

1. Silikon kalıpların hazırlanması
   1. 0,5 mm kalınlığında bir silikon tabakada delikler oluşturmak için istenen çapta bir biyopsi zımbası kullanın ve her deliğin etrafına bir kare kesin. İstenilen kalıp sayısı için tekrarlayın.
      NOT: Kalıpların çapı ve kalınlığı, belirli uygulama ve hücre kültürü koşulları için ayarlanabilir. Pratikte, 50 x 10⁶ hücre/mL'lik hücre kültürleri için, yeterli DNA/RNA ve protein ekstraksiyonu için sırasıyla 4 mm ve 5 mm çapında 0,5 mm kalınlığında küfler önerilmektedir. İmmün boyama için, 2 mm'lik bir biyopsi zımbası, kare kalıp başına üç bitişik delik oluşturmak için kullanılabilir, böylece oyuk başına üç kopya boyanabilir.
   2. Tek tek kalıbın her iki yanındaki plastik sargıyı cımbızla çıkarın.
      not: Kontaminasyon gelecekteki plazma bağlama verimliliğini azaltabileceğinden, açıkta kalan silikon yüzeyle temastan kaçının.
   3. Cımbız kullanarak, aynı sayıda çıplak silikon kalıbı ve cam lamelleri (No. 1, 12 mm çap) 48 oyuklu bir plakanın ters çevrilmiş kapağına alternatif sıralar halinde yerleştirin. Tamamlandığında, kontaminasyonu önlemek için 48 oyuklu plakanın kapağını kapatın.
   4. Oksijen plazması, 48 oyuklu plaka kapağının tamamını (yani kalıpları ve cam slaytları) işler. Hemen ardından, silikon kalıbı bitişik cam lamel üzerine ters çevirmek için forseps kullanın. Yapışmayı sağlamak için kalıba sıkıca bastırın. Kalıpların oda sıcaklığında 1 saat
      inkübe etmesine izin verin not: Oksijen plazma tedavisinin süresi, kullanılan alete bağlı olarak değişecektir. Cihazımız için tipik koşullar, 0,3-4 mbar arasında bir çalışma gazı basıncı penceresi, 20 cm³/dk'da oksijen gazı akışı ve numunenin 10-20 saniye boyunca plazmaya maruz kalmasıdır.
   5. Kalıpları otoklavlayarak sterilize edin. Kalıpları kullanılana kadar oda sıcaklığında steril bir ortamda saklayın.
      not: Kalıplar bu aşamada süresiz olarak saklanabilir.
2. Elastin benzeri protein stok çözeltisinin hazırlanması
   1. Liyofilize ELP'yi 4 °C depolamadan çıkarın. Tekrarlanan kullanımda protein üzerinde yoğuşma oluşmamasını sağlamak için tüpü açmadan önce proteini oda sıcaklığına ısıtın.
   2. ELP'yi Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininde (DPBS) 4 ° C'de gece boyunca sabit çalkalama (yani eğirme) ile çözün.
      not: ELP stok çözeltisi konsantrasyonu, kullanıcı tanımlı bir hacimsel oranda çapraz bağlayıcı çözeltisinin eklenmesiyle daha da seyreltilecektir. Örneğin, %3 (a/h) nihai ELP konsantrasyonu için, 3.75:4 hacimsel ELP çözeltisi:çapraz bağlayıcı çözeltisi oranında seyreltilecek %1 (a/h) bir ELP stok çözeltisi hazırlayın. İstenen uygulama için konsantrasyonu gerektiği gibi ayarlayın.
   3. Steril filtre 0.22 μm şırınga filtresi kullanan ELP stok çözeltisi. ELP'yi kullanılmadığı zaman buz üzerinde saklayın.
3. Biyogüvenlik kabininde, steril cımbız kullanarak steril kalıpları 24 oyuklu bir doku kültürü plakasına aktarın.
4. Tetrakis (hidroksimetil) fosfonyum klorür (THPC) stok çözeltisinin hazırlanması
   1. Kullanmadan hemen önce THPC'yi DPBS'de seyreltin. THPC çözeltisinin konsantrasyonunu nihai ELP konsantrasyonuna ve istenen çapraz bağlama oranına göre ayarlayın.
      not: Protokol için, ELP stok çözeltisinin THPC çözeltisi ile 4:1 hacimsel oranda karıştırılmasıyla %3'lük (a/h) bir nihai ELP konsantrasyonu yapılacaktır. Gerektiği gibi ayarlayın.
   2. 997,4 μL DPBS'ye 2,6 μL THPC çözeltisi (suda% 80) ekleyin.
      not: Bu THPC konsantrasyonu, nihai% 3 (a / h) ELP hidrojeli için tarif edilen 4: 1 hacimsel oranda çözeltileri karıştırırken, THPC üzerindeki hidroksi metil gruplarının ve ELP proteini üzerindeki birincil aminlerin 1: 1 stokiyometrik oranına karşılık gelir. THPC çözeltisi viskozdur ve çözelti damlacıkları pipet ucunun yan tarafına yapışabilir. Doğru konsantrasyonlar için, DPBS'ye seyreltirken bu tür damlacıklardan kaçının. Fosfinin oksidasyonunu ve çapraz bağlayıcının inaktivasyonunu önlemek için THPC stok kabını nitrojen gazı ile boşaltın.
   3. Karıştırmak ve buz üzerinde tutmak için çözeltiyi girdaplayın.
   4. 0.22 μm'lik bir şırınga filtresi kullanarak THPC stok çözeltisini steril filtreleyin. Daha düşük stokiyometrik çapraz bağlama oranları (örneğin, 0,5:1 veya 0,75:1) elde etmek için THPC stok çözeltisini steril DPBS ile daha da seyreltin.
      not: THPC oksijene duyarlıdır ve seyreltilmiş çözelti hazırlandıktan sonra birkaç saat içinde kullanılmalıdır.
5. Tripsin-EDTA ile inkübasyon yoluyla hücreleri tek hücreli bir süspansiyona ayırın, hücreleri pelet haline getirin ve bir hemositometre kullanarak ortamda yeniden süspanse edilen hücreleri sayın.
   not: Bu adım için kesin protokoller, büyük ölçüde istenen hücre tipine ve uygulamaya bağlı olacaktır. Bu protokol boyunca kullanılan nöral progenitör hücreler için, oda sıcaklığında 1.5 dakika boyunca% 0.025 Tripsin-EDTA inkübasyonu gerçekleştirildi. Hücreler 2 dakika boyunca 200 x g'da peletlendi. Hücre canlılığının artması için, hücreler normal ortam koşullarında askıya alınmalıdır. Hücre kapsülleme için kullanılan tipik hücre yoğunlukları, 1 - 50 x 10⁶ hücre/mL nihai hidrojel hacmi arasında değişir. Gerektiği gibi ayarlayın.
6. İstenilen sayıda hücreyi steril bir 1.5 mL santrifüj tüpüne alın.
7. Hücreleri ~ 200 x g'da 3 dakika santrifüjleyin. Dikkatlice, süpernatanı aspire edin ve hücre peletini buz üzerinde tutun.
   not: ELP ve THPC çapraz bağlayıcının daha fazla seyreltilmesini azaltmak için tüm süpernatanı tamamen aspire etmek çok önemlidir. Spesifik santrifüjleme hızları hücre tipine göre değişecektir.
8. Hücre peletini, hacim nihai hacmin %80'i olacak şekilde ELP stok çözeltisinde yeniden süspanse edin (4:1 ELP çözeltisi: THPC çözeltisi oranı varsayılarak). Homojen bir hücre ve ELP karışımı elde etmek için 20-25 kez pipet karıştırın.
   not: ELP'nin sıcaklık artışını ve müteakip faz geçişini azaltmak için tüpün altını tutmaktan kaçının. Üç kopyalı her 2 mm'lik kalıp, 3 deliğe eşit olarak bölünmüş 7,5 μL nihai hacim (yani 6 μL ELP stok çözeltisi ve 1,5 μL THPC stok çözeltisi) gerektirir (yani, delik başına 2,5 μL nihai hacim). 4 ve 5 mm'lik kalıplar için sırasıyla 7,5 μL ve 15,5 μL'lik bir nihai hacim gereklidir.
9. Kalan %20'lik nihai hacim için hücre/ELP süspansiyonuna THPC stok çözeltisi ekleyin. Homojen bir karışım elde etmek için 20-25 kez pipet karıştırın.
10. Karşılık gelen son hücre / ELP / THPC karışımını dairesel bir hareketle hemen her kalıba pipetleyin. Tüm kalıplar için tekrarlayın.
11. Numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin, ardından 37 ° C'de 15 dakika ek bir inkübasyon yapın.
    not: İlk inkübasyon periyodu, sıcaklığı ELP'nin düşük kritik çözelti sıcaklığının (LCST) üzerine çıkarmadan ve termal faz ayrışmasını indüklemeden önce hidrojelin ilk çapraz bağlanmasını kolaylaştırmaya yardımcı olacaktır.
12. Jelleri bozmaktan kaçınarak 24 oyuklu plakanın her bir oyuğuna yavaşça 750 μL ılık hücre kültürü ortamı ekleyin.
13. Hidrojelleri 37 °C'de 7 gün inkübe edin.
    not: Hücre tipine bağlı olarak her 1-2 günde bir tam orta değişiklikler önerilir. Jel üzerindeki baskıyı sınırlamak için, ortamı kuyudan aspire ederken 200 μL'lik bir pipet ucuyla yapıştırılmış bir cam Pasteur pipeti kullanın.

2. 3D ELP Hidrojellerinde Hücrelerin İmmünositokimyası

1. 30 mL DPBS'de 10 mL% 16 (a/h) paraformaldehit (PFA) karıştırarak fiksasyon çözeltisini hazırlayın. Çözeltiyi 37 °C'ye ısıtın.
2. Ortamı 24 oyuklu plakadan aspire edin ve 1 mL DPBS ile nazikçe yıkayın.
3. Her bir oyuğa 750 μL fiksasyon solüsyonu ekleyin ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Diğer kültürlerin PFA buharı ile kontaminasyonunu önlemek için doku kültürü inkübatörünü kullanmayın.
4. Sabitleme solüsyonunu her kuyucuktan dikkatlice aspire edin ve PFA'yı uygun bir tehlikeli atık kabına atın.
   Dikkat: PFA'ya maruz kalmak cilt ve göz tahrişine neden olabilir. Eldiven/koruyucu gözlük takın ve kimyasal davlumbazda çalışın.
5. Her numuneye 1 mL DPBS ekleyin. DPBS'yi hemen aspire edin ve PFA atık kabına atın.
6. Numuneleri 1 mL DPBS ile her biri 10 dakika boyunca iki kez yıkayın.
   not: Numuneler, plakayı Parafilm ile kapattıktan sonra bir haftaya kadar DPBS'de 4 °C'de saklanabilir.
7. Her numuneyi 750 μL geçirgenlik çözeltisi (100 mL DPBS ve 0.25 mL Triton X-100; PBST) 15 rpm'de bir külbütör üzerinde oda sıcaklığında 1 saat.
8. PBST'yi aspire edin ve her numuneye 750 μL bloke edici solüsyon (95 mL PBS, 5 g sığır serum albümini (BSA), 5 mL serum ve 0.5 mL Triton X-100) ekleyin. Oda sıcaklığında 15 rpm'de bir külbütör üzerinde 3 saat inkübe edin.
   not: Bloke edici çözelti, ikincil antikorların yükseltildiği konakçı türlerden serum içermelidir (ör., keçi, eşek) ve kullanımdan önce 0.22 μm'lik bir filtreden steril olarak süzülür.
9. Antikor seyreltme çözeltisini hazırlayın (97 mL DPBS, 2.5 g BSA, 2.5 mL serum (EPL'nin hazırlandığı aynı konakçı türden) ve 0.5 mL Triton X-100). Antikor seyreltme solüsyonunu kullanarak primer antikoru seyreltin ve her numuneye 500 μL solüsyon ekleyin. Plakayı Parafilm ile kapatın ve gece boyunca 4 °C'de bir külbütör üzerinde inkübe edin.
   not: Nestin ve Sox2 primer antikorları, üreticilerin orijinal konsantrasyonundan antikor seyreltme çözeltisinde 1:400 oranında seyreltildi.
10. Antikor çözeltisini her numuneden aspire edin ve numuneleri oda sıcaklığında 15 rpm'de bir külbütör üzerinde 60 dakika boyunca PBST ile yıkayın. Yıkama adımını 3 kez tekrarlayın.
11. Antikor seyreltme solüsyonunu kullanarak ikincil antikorları ve 5 mg / mL stok DAPI'yi (1: 2.000) seyreltin ve her numuneye 500 μL solüsyon ekleyin. 24 oyuklu plakayı alüminyum folyo ile örtün ve gece boyunca 4 °C'de bir külbütör üzerinde inkübe edin.
    not: İkincil antikorlar ışığa duyarlı olduğundan, numuneler sonraki tüm adımlar için foto ağartmadan korunmalıdır. Keçi anti-fare ve keçi anti-tavşan ikincil antikorları, üreticilerin orijinal konsantrasyonundan antikor seyreltme çözeltisi içinde 1:500 oranında seyreltildi.
12. Antikor solüsyonunu her numuneden aspire edin ve numuneleri külbütör üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBST ile yıkayın. Yıkama adımını 3 kez tekrarlayın.
13. Bir cam sürgünün yüzeyine bir damla sert ayarlanmış montaj ortamı yerleştirin. Forseps kullanarak, kalıbın kenarını bir kağıt havlu üzerine hafifçe lekeleyerek fazla çözeltiyi kalıptan çıkarın. Kalıbı dikkatlice baş aşağı montaj ortamına yerleştirin ve kabarcık oluşturmaktan kaçının.
14. Montaj ortamının oda sıcaklığında 48 saat sertleşmesine izin verin. Numuneleri oda sıcaklığında veya 4 °C'de saklayın. Ortamın kırılma indisi sertleşme boyunca değişeceğinden, görüntülemeden önce montaj ortamının 48 saat boyunca tam olarak ayarlanmasına izin verin. Kontaminasyonu veya numune hareketini azaltmak için numuneleri şeffaf oje ile cam kapak sürgüsüne kapatın.
15. Numuneleri konfokal bir mikroskop kullanarak görüntüleyin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
3D ELP Hidrojellerde Hücre Kapsülleme
0,22 μm şırınga filtreleri	Kırlangıç	SLGV004SL
0,5 mm kalınlığında silikon levha	Elektron Mikroskobu Bilimi	70338-05
24 oyuklu doku kültürü plakaları	Corning	353047
Tek Kullanımlık Biyopsi Punch (2 mm)	Integra Miltex	33-31
Tek Kullanımlık Biyopsi Punch (4 mm)	Integra Miltex	33-34
Tek Kullanımlık Biyopsi Punch (5 mm)	Integra Miltex	33-35
Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS)	Corning	21-031-CM
1 adet 12 mm cam lamel	Thermo Fisher Bilimsel	12-545-80
Tetrakis (hidroksimetil) fosfonyum klorür (THPC)	Sigma-Aldrich	404861-100ML
%0,5 Tryspin/EDTA	Termo Balıkçı	15400054
3D ELP Hidrojellerdeki Hücrelerin İmmünositokimyası
%16 (a/h) Paraformaldehit (PFA)	Elektron Mikroskobu Bilimleri	15701
Sığır Serum Albümini (BSA)	Roche	3116956001
DAPI (4',6-Diamidino-2-fenilindol, dihidroklorür)	Moleküler Problar	D1306
Eşek Serumu	Lampire Biyolojik Laboratuvarları	7332100
Keçi anti-fare İkincil Antikoru (AF488)	Moleküler Problar	A-11017
Keçi anti-tavşan İkincil Antikoru (AF546)	Moleküler Problar	A-11071
Keçi Serumu	Gibco (Gibco)	16210-072
Fare Nestin Birincil Antikoru	BD Pharmingen	556309
Fare Sox2 Birincil Antikoru	Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi	23064S
oje	Elektron Mikroskobu Bilimleri	72180
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML
Vectashield Sert Montaj Ortamı	Vektör Laboratuvarları	H-1400

arası Gazetesi Serisi Serisi Serisi Serisi Gazetesi Serisi