$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Antikor Peptit Konjugasyonu
NOT: NLS'ye (ChAcNLS) bağlı kolik asit, herhangi bir ticari peptit üreticisinde veya üniversiteye bağlı peptit sentezi hizmet platformunda sentezlenebilir.
- 1.7 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde, fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.6 içinde 10 mg / mL (~ 1 mg toplam antikor) 7G3 çözeltisi hazırlayın.
- Sülfosüksinimidil 4- (N-maleimidometil) sikloheksan-1-karboksilatı (sülfo-SMCC) dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 5-10 mM'lik bir konsantrasyonda çözün. Çözeltiyi iyice girdaplamak, tam bir çözünme elde etmek için en iyi sonucu verir.
- 7G3 içeren tüpe çözünmüş kükürt-SMCC çözeltisini ekleyin (istenen sülfo-SMCC-7G3'ün molar oranına bağlı olarak tipik olarak 5-20 μL arasında). 10, 25 ve 50'ye 1 sulfo-SMCC-7G3 oranlarının test edilmesi önerilir. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
- Malimid türevli 7G3'ü bir ultrafiltrasyon cihazı ve PBS, pH 7.0'da tampon değişimi kullanarak saflaştırın ve konsantre edin. 8.000 x g'da yaklaşık 5 dakika santrifüjleyin. Akışı atın ve PBS, pH 7.0 ile doldurun ve tekrar santrifüjleyin.
- Tamponu tamamen değiştirmek için bunu 7-8 kez gerçekleştirin. Filtre cihazını temiz bir mikrosantrifüj tüpüne baş aşağı yerleştirerek konsantre 7G3 proteinini geri kazanın. 1.000 x g'da 2 dakika santrifüjleyin. Kurtarma hacmi yaklaşık 0.3 mL olmalıdır.
- Maleimid ile aktive edilen 7G3 içeren tüpte, önceki adımda kullanılan sülfo-SMCC-7G3 oranına göre 2 kat fazla ChAcNLS ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Örneğin, 10'a 1 sulfo-SMCC-7G3 oranı kullanılmışsa, 20'ye 1 ChAcNLS-7G3 oranı kullanın. Toplam hacim önemli ölçüde değiştirilmemelidir.
not: ChAcNLS, konjugasyon işlemi sırasında çökelmeye neden olmasa da, bu diğer peptitlerde meydana gelebilecek bir olasılıktır. Reaksiyon sırasında, büyük olasılıkla peptitler hidrofobik olduğunda ortaya çıkan çökelme belirtileri için tüpü gözlemleyin. Bu durumlarda, artan hidrofiliklik sağlamak için değişiklikler tasarlamak için ilgilenilen peptidi tekrar gözden geçirmeye değer olabilir.
- 7G3-ChAcNLS'yi bir ultrafiltrasyon cihazı kullanarak PBS pH 7.4'te istenen konsantrasyona ve tampon değişimine konsantre edin (bkz. adım 1.4). Toplam proteinin geri kazanım verimi, orijinal başlangıç materyalinin ≥% 75'i olmalıdır.
- %12'lik bir poliakrilamid jel kullanarak yapılandırılmış 7G3-ChAcNLS adaylarını değerlendirmek için sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) gerçekleştirin (ChAcNLS konjuge ağır ve hafif zincirlerin konjuge olmayan zincirlerden yeterli şekilde ayrılmasını sağlar). 10 μg 7G3-ChAcNLS'yi 2 μL β-merkaptoetanol içeren PAGE yükleme tamponunda karıştırın ve kuyuya yükleyin.
- Uygun voltajı ayarlayın (% 12 jel için 1 saat boyunca 120 V) ve elektroforezi çalıştırın. Coomassie boya cephesi jelin dibine ulaştığında elektroforezi durdurun.
not: Coomassie boya cephesinin jelden akmasına izin vermeyin.
- Jeli elektroforez aparatından çıkarın ve %10 v/v buzlu asetik asit ve %20 v/v metanol içeren leke giderme solüsyonu ile durulayın.
- Jelin bir fotoğrafını çekin ve bir cetvel ile standartlar ve 7G3 konjugatları için taşınan mesafeyi (cm) ölçün. Taşınan mesafenin jel uzunluğuna bölünmesiyle elde edilen tutma faktörü (Rf) değerini hesaplayın (proteinin yüklendiği yerden Coomassie göç cephesine). Moleküler ağırlığı (MW) her bir protein standardından Rf değerlerine karşı log olarak çizin ve 7G3 konjugatlarının boyutunu tahmin edin.
- 7G3 konjugatları ve modifiye edilmemiş 7G3 arasındaki MW farkını 1768.5 g/mol'e (MW ChAcNLS) bölerek antikor başına peptit sayısını hesaplayın.
- Coomassie lekeli jelin dijital görüntülerini alın ve dansitometri analizi yapın. Bu noktada, bir lider adayının seçimi, önemli agrega türleri içermeyen maksimum sayıda ChAcNLS molekülüne sahip AC'ye dayanabilir.
2. Hücre İçi Birikim Değerlendirmesi için Konfokal Mikroskopi
NOT: İlgilenilen bir yük ile formülasyonlar geliştirmeden önce, peptit ile modifiye edilmiş mAb'lerin hücre içi birikiminin hücre seçiciliğini test etmek önemlidir. Tat'ın spesifik olmayan hücre penetrasyonu için bir eğilimi olduğu da gösterildiğinden, pahalı yüklerle maliyetli geliştirme adımlarını atmadan önce hücre içi birikimi ve hücre seçiciliğini analiz etmeye değer. Bu nedenle, Prosedür 1, izotipe özgü ilgisiz kontrol mAbs'lerini de değiştirmelidir. Protokolün geri kalanı için, antikor başına 10 ChAcNLS molekülü ile modifiye edilmiş AC'lerle çalışacağız. Prosedür 2 ve 3 için temel adımları içeren bir şema Şekil 1'de açıklanmıştır.
DİKKAT: Protokolün bu adımı, paraformaldehitin işlenmesini ve manipülasyonunu içerir. Lütfen kullanırken üreticinin talimatlarına uyun.
- Hedef TF-1a hücrelerini, modifiye edilmiş kontrol mAb'leri dahil olmak üzere 200 nM 7G3-ChAcNLS ile tedavi edin. 5 x 106 antijen pozitif hücreyi konjugatlarla 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
- 1 saat sonra, süpernatanı çıkarın ve buz gibi soğuk PBS'de 1 mL 3x ile yıkayın. Taze besiyeri ekleyin ve 37 °C'de bir saat daha inkübe edin.
- Ek bir saat sonra, süpernatanı çıkarın ve 1 mL buz gibi soğuk PBS'de 3 kez yıkayın. 37 ° C'de 3 ila 30 dakika boyunca% 0.25 tripsin ve etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içeren 0.5 mL PBS ekleyin.
not: İlk pilot test sırasında, AC hücre içi birikimdeki farklılıkları belirlemek için hücrelerin tripsinize edilmemesi önerilir. Bu protokol tripsin kullanımını teşvik eder ve bunun farklı AC adaylarının hücre içi birikim verimliliğinin değerlendirilmesini nasıl geliştirdiğini gösteririz.
- Tüm hücrelerin ayrılıp ayrılmadığını görsel olarak kontrol ederek inkübasyon için farklı zamanları test edin. Ek olarak, hücre alikotlarını canlılık boyama solüsyonları ile inkübe edin ve daha önce tarif edildiği gibi akış sitometrik analizi yapın.
- Tripsini 1.5 mL hücre kültürü RPMI 1640 ortamı /% 10 fetal sığır serumu ile nötralize edin. Hücreleri 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve 0,5 mL buz gibi soğuk PBS'de 3 kez yıkayın.
- % 1 paraformaldehit ve% 1 sakaroz içeren 0.5 mL PBS'deki hücreleri 30 dakika boyunca buz üzerinde sabitleyin. Hücreleri 0.5 mL buz gibi soğuk PBS'de 3 kez yıkayın ve 5 dakika boyunca 250 x g'da santrifüjleyin. % 0.15 Triton X-100 içeren 0.5 mL PBS'deki hücreleri buz üzerinde 5 dakika boyunca geçirgen hale getirin. Hücreleri buz gibi soğuk PBS'de yıkayın ve santrifüjlemeyi tekrarlayın.
- Karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat boyunca AlexaFluor 647'ye konjuge edilmiş bir anti-murin (izotipe özgü) Fc ikincil poliklonal antikorun 2 μg / mL (veya üreticinin önerdiği konsantrasyon) içeren 0.1 mL PBS'de hücreleri askıya alın.
- 5 dakika boyunca 250 x g'da santrifüjleyin ve hücreleri 0,5 mL buz gibi soğuk PBS'de 3 kez yıkayın. Hücreleri 0,5 mL PBS.
içinde askıya alın
Duraklat: Hücreler buzdolabında saklanabilir.
not: İlgilenilen mAb'nin doğru izotipini tanıyan ikincil bir antikorun seçilmesi önemlidir. AF647, çekirdeğin propidyum iyodür (PI) boyamasına müdahale etmeyen uzak kızılötesi emisyonu nedeniyle seçilmiştir.
- Hücreli kaba 10 μg / mL'lik bir konsantrasyona PI ekleyin. Ardından, 1 x 105 hücreyi montaj ortamını kullanarak cam kızaklara monte edin ve bir cam lamel ile örtün.
- Hücreleri, ters lazer taramalı konfokal mikroskopta Plan Apo 60X yağa daldırma objektifi NA 1.42 ile inceleyin. 488 nm argon lazeri ve 600 - 650 nm için ayarlanmış spektral tarama prizmasını kullanarak PI floresansını tespit edin. AF647 floresan için 633 nm helyum-neon lazer ve 650 - 700 nm için ayarlanmış spektral tarama prizmasını kullanın. PI ve AF647'den floresan emisyonlarını sırayla toplayın.
not: Hücrelerin değerlendirilmesi ve karşılaştırılması boyunca aynı ayarı kullanın. Bununla birlikte, tripsinizli hücreler için ayarları, tripsinizli olmayan hücrelere kıyasla ayarlamanız gerekecektir.
- Görüntüleri elde etmek için mikroskop yazılımı kullanın. Tüm hücre kalınlığı boyunca 0,5 μm aralıklarla alınan 2X çizgi ortalaması ile 1.024 x 1.024 piksellik seri yatay optik bölümler kullanarak görüntüleri toplayın. Görüntüleri, maksimum floresan yoğunluğunda art arda dört dilimden yığılmış z-projeksiyonları olarak sunun.
- Mikroskop yazılımı ile hücreleri analiz edin. Konjugatların hücresel dağılım modelini kaydedin. Spesifik olarak, sitoplazmadaki hücre içi floresansın gruplanmış ve hücre yüzeyine yakın mı yoksa dağınık ve homojen mi olduğunu değerlendirin. Ayrıca hücre başına bağıl floresan yoğunluğunu da değerlendirin.
