Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Stereotaksik Cerrahi Öncesi Kateter Hazırlığı
- Kanülü ozmotik pompalara bağlamak için kullanılacak PE50 kateterlerini (6 cm uzunluğunda) kesin (bkz. Şekil 1). PE50 kateterlerini yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) ile doldurun ve kateterlerin her iki ucunu kapatın. Kateteri kullanılana kadar 4 °C'de tutun.
2. Stereotaksi ile Kanül İmplantasyonu
- Ameliyatı steril koşullarda gerçekleştirin. Tüm cerrahi alet ve malzemeleri otoklavlama ile sterilize edin. Stereotaksik cihazı ve çalışma alanını iyice temizleyin ve% 70 etanol çözeltisi ile dezenfekte edin. Cerrahi maske, saç bonesi ve steril eldiven giyin.
- Sıçanları intraperitoneal (i.p.) bir ketamin ve ksilazin çözeltisi (sırasıyla 100 mg / kg ve 10 mg / kg) enjekte ederek anestezize edin. Hafifçe ayak parmağınızı sıkıştırdıktan sonra hareketi kontrol ederek anesteziyi onaylayın.
- Ameliyattan en az 30 dakika önce anestezi uygulanmış hayvana steroid olmayan bir antienflamatuar ilaç (Meloksikam; 1 mg / kg) deri altına (s.c.) enjekte edin.
- Hayvanın kafasını makas kullanarak tıraş edin ve cildi% 2 klorheksidin glukonat ve% 2 izopropil alkol çözeltisi ile üç kez dezenfekte edin. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlere veteriner oftalmik merhem sürün.
- Hayvanı kulak çubuklarıyla stereotaksik bir çerçeveye yerleştirin. Stereotaksik çerçevenin tutucu koluna bir kanül sabitleyin. Başın üstüne lokal anestezik bir ajan (bupivakain (1.5 mg / kg) ve lidokain (1.5 mg / kg) enjekte edin. Anestezi, tüm prosedür boyunca% 3 izofluran sağlayan bir burun konisi yerleştirilerek sürdürülür. Tüm cerrahi alanın örtülmesi gerekir, ancak burada tekniği daha iyi göstermek için yapılmadı.
- Bir neşter ile başın üst kısmında 3 cm'lik bir kesi yapın. Kafatasını temiz bırakmak için kesiğin etrafına 4 kelepçe takın. Yuvarlak uçlu bir makas kullanarak, hayvanın omuz bıçakları arasında derinin altına bir cep (2 x 2 cm2) yapın.
- Kafatasının periosteumunu bir bıçakla kazıyın. Kanaması varsa kafatasına bir gazlı bez sürün.
- Kafatasının düz olduğunu ve stereotaksik çerçeve üzerinde iyi hizalandığını doğrulayın. Kafatasının düz olduğundan emin olmak için bregma ve lambda'daki yükseklik koordinatlarını kontrol edin. Referans noktası olarak kullanılacak bregma koordinatlarını alın.
- Bregmadan başlayarak, hipokampusa bilateral olarak implante edilecek iki kılavuz kanülün koordinatlarını hesaplayın (ön-arka: - 0.42 cm; mediolateral: ± 0.30 cm; dorsoventral: - Paxinos ve Watson sıçan beyin atlasına göre). Kanülün konumunu bir işaretleyici ile belirtin.
- Her iki kanülün implantasyon noktasında kafatasında bir delik (0,5 mm) açın. Diş çimentosu uygularken kanülü katılaştıracak vidaları yerleştirmek için bu noktaların yaklaşık 5 mm yukarısına ve altına iki delik daha açın.
- Daha önce aCSF ile doldurulmuş kateterin bir ucunu neşter ile kesin ve kanülün açılı koluna yerleştirin. İlk kanülü diş çimentosu ile sabitleyin. İkinci kanül üzerindeki pozisyonun etrafına diş çimentosu koymaktan kaçının.
- Diş çimentosunu 2-3 dakika kurumaya bırakın, ardından ilk kanülden tutucu kolu çıkarın ve ikinci kanülü içine sabitleyin. 2.11 ve 2.12 adımlarını tekrarlayın. Her iki kılavuz kanülün üzerine sahte bir kanül koyun. Doku infiltrasyonunu ve kanülün tıkanmasını önlemek için kukla ve kılavuz kanülün aynı uzunlukta olduğundan emin olun.
- Her iki kateterin serbest ucunu, daha önce hayvanın kürek kemikleri arasında yapılan cebe yerleştirin. Kelepçeleri çıkarın ve cildi 4-0.
bir dikiş ipliği ile dikin
not: Üst kılavuz kanül, yaklaşan Aβo infüzyonları için erişilebilir olmalıdır.
- Hayvanı stereotaksik çerçeveden çıkarın ve kafesine geri koyun. Ameliyat sonrası iyileşme sırasında, hayvan uyanana kadar kafesi bir ısıtma suyu battaniyesinin üzerine yerleştirin. Kafes kısmen pedin üzerinde olmalıdır, böylece sıçan gerekirse ısıdan kaçabilir. Sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı sürekli izleyin.
- Ameliyattan sonra 10 gün boyunca yakın izleme altında iyileşmek için fareleri hayvan tesisine geri koyun.
not: Ameliyat geçirmiş bir hayvanı, tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirketine iade etmeyin. Meloksikam (1 mg / kg), ağrıyı tedavi etmek için ameliyattan sonraki iki gün boyunca günde bir kez verilir.
3. Ozmotik Pompa Kurulumu
- Kurulumdan bir gün önce ozmotik pompaları 6E10 antikoru (1 mg/ml; 100 μl) ile doldurun ve steril koşullar altında üreticinin talimatlarına göre IgG1 antikorunu (1 mg/ml; 100 μl) kontrol edin. Pompaları etkinleştirmek için pompaları gece boyunca 37 °C'de steril damıtılmış suda tutun.
- Ozmotik pompaları (7 gün boyunca 0,5 μl / saat) kurmak için sıçanları% 3 izofluran ile uyuşturun. Omuz bıçakları arasında tıraş olun ve cildi% 2 klorheksidin glukonat ve% 2 izopropil alkol çözeltisi ile dezenfekte edin. Kılavuz kanüle bağlı PE2 kateterlerini bulmak için kürek kemikleri arasında bir neşter ile 50 cm'lik bir kesi yapın.
- Diş çimentosu içeren PE50 kateterlerinin ucunu neşter ile kesin. Ozmotik pompaları PE50 kateterlerine bağlayın ve bağlantıyı sabitlemek için pompa ve kateter bağlantısına bir miktar diş çimentosu ekleyin.
- Cildi 4-0 dikiş ipliği ile sıkıca dikin. Hayvanı kafesine geri koyun ve bir ısıtma suyu yastığının üzerine koyun. Hayvanın izofluran anestezisinden (yaklaşık 5 dakika) hızla uyandığını gözlemleyin.
not: Ameliyat yaklaşık 5 ila 10 dakika sürer.
>4. Uyanık ve Serbestçe Hareket Eden Sıçanlarda Aβo İnfüzyonları
- Aβo çözeltisini (0.2 μg/μl) hazırlayın. Aβo'nun infüzyondan önce oda sıcaklığında 1 saat boyunca dinamik ve kendiliğinden toplanmasına izin verin.
- Bir infüzyon pompasına iki adet 10 μl şırınga takın. Şırıngaları 5 μl steril damıtılmış su ile doldurun. Bir neşter ile yaklaşık 60 cm uzunluğunda iki PE50 kateteri kesin. Her iki kateteri de 1 ml şırınga ve 21G iğne kullanarak steril damıtılmış su ile doldurun.
- 1 ml'lik şırıngaları kateterin bir ucunda tutun ve diğer ucunu Hamilton şırıngalarına bağlayın. 1 ml'lik şırıngaları çıkarın ve kateterlerin içinde hava kabarcığı olmadığını kontrol edin.
- Dahili kanülü PE50 kateterlerinin ucuna yerleştirin. Steril damıtılmış su kullanarak, PE50 kateterlerine bağlı dahili kanülü Hamilton şırıngalarına 1 μl'ye kadar doldurun. Pistonları 2 μl'ye kadar geri çekerek bir hava kabarcığı yapın.
- Aβo solüsyonunu, minimum yapışma ucu kullanarak yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Karıştırma sırasında kabarcık oluşturmaktan kaçının. Pistonları 3,5 μl'ye kadar geri çekerek her iki iç kanülü de 1,5 μl Aβo solüsyonu ile doldurun.
- Her iki kateterde hava kabarcığından önce ve sonra bir işaretleyici ile çizgiler yapın. Bu, devam eden infüzyon için bir kontrol noktası görevi görür. İnfüzyon için kafesi infüzyon pompasının yanına getirin ve kapağını çıkarın.
- Fareyi bir sucağa yerleştirin ve farenin başını hareketsiz hale getirmek için snuggle kolunu boynuna sıkıca kazıyın. Kukla kanülü iki kılavuz kanülden çıkarın. Daha önce hazırlanmış olan iç kanülü kılavuz kanüle yerleştirin. Kılavuz kanülün tabanına tam olarak yerleştirildiklerini ve iyi bir şekilde sabitlendiklerini doğrulayın.
- Fareyi kucağından serbest bırakın ve çekişme stresini sınırlamak için kafesine geri koyun. Kateterlerin birlikte bükülmediğinden ve infüzyonun doğru şekilde yapıldığından emin olmak için yakından izleyin.
- İnfüzyon pompasını açın. 0.1 μl / dak (10 dakika) oranında 1 μl Aβo çözeltisi enjekte edin. İnfüzyon sırasında, şırınga pistonunun 3,5 μl'den 2,5 μl'ye hareket ettiğini ve her iki PE50 kateterindeki hava kabarcığının sürekli hareket ettiğini kontrol edin.
- Aβo çözeltisinin verimli bir şekilde difüzyonunu sağlamak için infüzyondan sonra iç kanülü 5 dakika daha yerinde bırakın. Enjekte edilen solüsyonun geri akışını önlemek için iç kanülü ve kapaklı kılavuz kanülü çıkarmak için fareyi tekrar sucağa getirin. Kanülün açı kolundan hemen önce duran sahte bir kanül kullanın. Hayvanı kafesine geri koyun.
- Aβo infüzyonunu art arda 6 gün boyunca günde bir kez tekrarlayın. Hayvanı dekapitasyon ile ötenazi yapın.
