$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Kapasitif immünoprob üretimi ve işlevselleştirme
- 25 cm uzunluğunda perfloroalkoksi (PFA) kaplı platin tel kesin (Malzeme Tablosuna bakın) ve platin teli kesmemeye dikkat ederek bir neşter kullanarak bir ucundan yaklaşık 5 mm PFA kaplamayı soyun.
- Platin telin soyulmuş ucunu altın kaplama 1 mm erkek konektör pimine yerleştirin ve konektör pimi dişlerini pense kullanarak platin telin soyulmuş ucunun etrafına sıkın (bkz. Malzeme Tablosu).
- Platin teli altın kaplama konektör pimine lehimleyin. Aşırı miktarda lehim kullanmamaya dikkat edin.
- 50 mg dopamin HCl'yi 50 mL 10 mM fosfat tamponlu salin (PBS, pH 6.0) içinde karıştırarak çözerek dopamin çözeltisi hazırlayın.
- Dopamin tamamen çözüldüğünde, platin telin ucunu taze yapılmış dopamin takviyeli PBS'yi içeren kaba yerleştirin. Altın konektör pimini başlığın bir kanalına takıntage (Malzeme Tablosuna bakın).
- Gümüş klorür (AgCl) disk elektrodunu (toprak elektrodu, Malzeme Tablosuna bakın) başlıktaki topraklama kanalına bağlayın.tage. AgCl diskini dopamin takviyeli PBS ve platin tel içeren kaba yerleştirin; Sadece disk elektrodunu batırmaya dikkat edin, telin veya lehimin herhangi bir uzunluğunu değil. Devam etmeden önce başlığın referans kanallarına bir kablo şönt bağlayın.
- Etkileşimli veri toplama yazılımını açın (bkz. Malzeme Tablosu). Aşağıdaki parametrelerle bir testere dişi elektrodepozisyon komut potansiyeli protokolü hazırlayın: başlangıç potansiyeli = -0,6 V; bitiş potansiyeli = +0.65 V; tarama hızı = 0.04 V∙s-1; biriktirme süresi = 420 s. Tüm kabloların doğru şekilde bağlandığından emin olarak polidopamin biriktirme protokolüne başlayın.
- Polidopamin birikimini tamamladıktan sonra, platin tel elektrodun ucunu rahatsız etmemeye dikkat ederek AgCl öğütülmüş peletini ve platin telin ucunu damardan çıkarın. Antikor çözeltisi hazırlanırken telin ucunu 2-5 dakika boyunca PBS (pH 7.4) içeren bir mikrotüpe yerleştirin; Tel ucunun mikrotüpün yanlarına veya altına temas etmediğinden emin olun.
NOT: Polidopamin birikimi sırasında antikor çözeltisi yapılabilir; bununla birlikte, platin telin dopamin içeren kaptan polidopamin birikimini takiben PBS'nin mikrotüpüne transferi atlanmamalıdır.
- Antikor çözeltisini hazırlayın. İlgilenilen antikoru PBS (pH 7.4) ile uygun büyüklükteki bir kapta (örneğin bir mikrotüp) 1:20 oranında birleştirin.
NOT: Burada kullanılan anti-nöropeptid Y (anti-NPY) monoklonal antikoru (Malzeme Tablosuna bakınız) 1 mg / mL'de aliquote edilmiştir; burada örnek bir antikor preparasyonu, 76 μL PBS'ye karşı 4 μL antikor olacaktır.
- Platin elektrotun polidopamin ile biriktirilen ucunu oda sıcaklığında en az 2 saat antikor çözeltisine batırın, yine platin tel ucunun çözelti içinde süspanse edildiğinden ve mikrotüpün iç yüzeyinde durmadığından emin olun.
NOT: Bu tekniğin yakın zamanda uygulanması, daha sonra kullanmak üzere ıslak veya kuru depolama yerine bu adımdan hemen sonra platin tel elektrotun kullanılmasını tercih etmiştir.
- Antikor çözeltisine batırıldıktan sonra, yeni işlevselleştirilmiş kapasitif immünoprob (CI probu) ucunu PBS'de (pH 7.4) kısaca durulayın. Prob artık kullanıma hazırdır.
2. Peptitin in vitro tespiti ve ölçümü için deney düzeneği
- Koklear implant probunun işlevsel ucunu akış odasına yerleştirin, elektrotun ucunu herhangi bir şekilde rahatsız etmemeye dikkat edin, aksi takdirde probun duyusal ucuna zarar verebilir.
NOT: Akış odası, silikon elastomerin (Malzeme Tablosuna bakınız) 35 mm'lik bir kültür kabına dökülmesiyle oluşturulmuştur ve yemeğin ortasında uzun bir oval boşluk dolgusu bulunur. Sertleştikten sonra oval şekil elastomerden çıkarılır. Oda daha sonra Tris tamponlu salin (TBS) ile süperfüze edilir ve 3 mL / dk'lık bir akış hızına izin verilir. Giriş ve çıkışın haznedeki sıvı seviyesini, süperfüzyonun gelgit hareketi gözlenmeyecek şekilde koruduğundan emin olun. CI probu kullanımda olduğu sürece akış yerinde kalmalıdır.
- İlk deneysel testten önce, CI probunu koşullandırmak için bir TBS standart çalıştırması gerçekleştirin. Aşağıdaki komut voltajı protokolünü ayarlayın: pozitif adım potansiyeli = +100 mV; negatif adım potansiyeli = −5 mV; adım süresi = 20 ms; edinme süresi = 600 s.
NOT: Veri toplamadan önce döngü komut potansiyelinin ilk aşaması sırasında probun dengelenmesine izin vermek önemlidir.
- Süper fustatın bileşimini korumak için aynı TBS'yi kullanarak ilgilenilen peptidin bir çözeltisini oluşturun. Süperfüzyonun, boru sistemine veya akış odasına kabarcıklar sokmadan TBS ve peptit takviyeli TBS arasında değiştirilebileceği bir manifold sistemi kurun.
NOT: Bu çalışmada sentetik domuz NPY peptidi (bkz. Malzeme Tablosu) kullanılmıştır.
- TBS standart parametrelerini kullanarak peptit algılama veri toplama protokolünü ayarlayın (bkz. adım 2.2.).
NOT: Bu uygulamada, her deneysel testin süresi 360 s idi (120 s TBS, 120 s peptit takviyeli TBS, 120 s TBS).