1. Etiketleme Öncesi Hazırlık
- Primer hipokampal kültürlerin hazırlanması ve sürdürülmesi
- Poli-D-lizin kaplı (0.1 mg / mL) 18 mm örtü camları üzerine kaplanmış 150.000 hücre yoğunluğunda birincil hipokampal kültürler hazırlayın. Dissosiyasyon nöronal kültür hazırlığı için mükemmel kılavuzlar mevcuttur.
not: Gerekirse, preparatta glial proliferasyonu önlemek için kültürler sitozin arabinosid (Ara-C, in vitro 1 [DIV1]) günlerinden 10 μM) ile muamele edilebilir.
not: Poli-D-lizin yerine fibronektin (1 mg / mL) veya laminin (5 μg / mL) gibi alternatif kaplama reaktifleri kullanılabilir.
- Kültürleri bir hücre inkübatöründe 37 ° C ve% 5 CO'datutun 2 B27 ve 2 mM L-glutamin ile desteklenmiş 2 mL / kuyu nörobazal ortamda.
not: İstenirse L-glutamin ikameleri (örneğin, Glutamax) kullanılabilir.
- Haftalık olarak, medya hacminin yarısını çıkarın ve aynı hacimde takviye edilmiş nörobazal medya ile değiştirin.
- İSTEĞE BAĞLI: Mutasyona uğramış ve/veya epitop etiketli reseptörlerin transfeksiyonu
NOT: Nöronlar, reseptör ekspresyonuna izin vermek için analiz zaman noktasından en az 3-4 gün önce transfekte edilmelidir. Genç nöronların (DIV6-9) kullanılması, daha yaşlı (DIV15-20) nöronlardan daha iyi transfeksiyon verimliliği ile sonuçlanır, ancak kullanılan DIV'den bağımsız olarak yeterli sayıda transfekte hücre (>20) elde edilebilir.
- 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğu için, bir mikrosantrifüj tüpünde B27 veya glutamin takviyesi olmadan 100 μL taze nörobazal ortamda ilgilenilen yapıyı içeren 1.5 μg plazmidi seyreltin ve hızlı bir şekilde girdaplayarak karıştırın.
not: Başarılı bir transfeksiyon için, kullanılan nörobazal ortamın mümkün olduğunca taze olması, ideal olarak şişenin açılmasından sonra 1 haftadan daha kısa bir süre içinde olması çok önemlidir.
- İkinci bir mikrosantrifüj tüpünde, 1 μL uygun bir lipofeksiyon reaktifini 100 μL taze nörobazal ortamda karıştırın ve hafifçe karıştırın.
not: Lipofeksiyon reaktif karışımını girdap haline getirmeyin. Taze lipofeksiyon reaktiflerinin kullanılması, transfeksiyon verimliliğini artırabilir.
- Tüpleri oda sıcaklığında (RT) 5 dakika inkübe edin.
- Lipofeksiyon reaktif karışımını DNA karışımına damla damla ekleyin, hafifçe karıştırın ve RT'de 20 dakika inkübe edin.
- Her bir kuyucuktaki ortamın hacmini 1 mL koşullu ortama ayarlayın.
- Lipofeksiyon reaktifi -DNA karışımını kuyuya damla damla ekleyin.
- Hücreleri inkübatöre geri koyun ve protein ekspresyonu için en az 3-4 gün bekleyin.
not: Aşağıda özetlenen içselleştirme ve geri dönüşüm protokollerinin amaçları doğrultusunda, hipokampal nöronlar, hücre dışı alanda (GFP-GluN2B) yeşil floresan proteini (GFP) ile etiketlenmiş GluN2B'yi ifade eden yapılarla DIV11-12'de transfekte edildi ve DIV15-16'da görüntülendi.
- İSTEĞE BAĞLI: Hücrelerin ilaçlarla (kronik veya akut) şartlandırılmış ortamda fiksasyona kadar inkübasyonu.
NOT: Akut tedavi için, etiketlemeden önce hücreleri tedavi etmeye başlayın. Kullanılan ilaç tedavi protokolüne bağlı olarak, hücreler 2. bölüm boyunca ilaç içeren ortamlarda muhafaza edilebilir. Örneğimizde, DIV21 hücreleri, yüzeyde eksprese edilen α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolepropiyonik asit reseptörünü (AMPAR) artırmak için kimyasal olarak indüklenen uzun süreli bir güçlendirme (cLTP) protokolüne tabi tutuldu.
- Hücre dışı çözelti (ECS) için koşullu ortamı değiştirin.
- Hücreleri RT'de 3 dakika boyunca ECS'de 300 μM glisin ile tedavi edin. Kontrol olarak, bir kardeş lamel ECS ile (glisin olmadan) tedavi edin.
- Hücreleri 3x 37 °C ECS ile yıkayın ve ECS'deki hücreleri (glisin olmadan) bölüm 2.
ile devam etmeden önce 20 dakika hücre inkübatörüne geri koyun.
NOT: ECS (mM cinsinden): 150 NaCl, 2 CaCl2, 5 KCl, 10 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES), 30 Glikoz, 0.001 tetrodotoksin (TTX), 0.01 striknin ve pH 7.4'te 0.03 pikrotoksin.
2. Yüzey İfade Edilen Reseptörlerin Canlı Etiketlenmesi
- Etiketleme için lameller hazırlayın
- Reaktifleri kaydetmek ve manipülasyonu kolaylaştırmak için, lamelleri hücre tarafı yukarı bakacak şekilde parafin film kaplı bir tepsiye aktarın.
NOT: Numunelerin kurumasına asla izin vermemek çok önemlidir.
- İnkübasyon ve yıkama adımları için şartlandırılmış ortamı 37 °C'de saklayın ve koruyun.
not: 18 mm'lik bir lamel için, antikor etiketlemesi için 75-100 μL ortam ve içselleştirme/geri dönüşüm için 120-150 μL ortam ile inkübasyon önerilir.
- Yüzey reseptörlerinin primer antikor ile etiketlenmesi
- Hücreleri şartlandırılmış ortamda seyreltilmiş birincil antikor ile RT.
'de 15 dakika inkübe edin
not: GFP etiketli reseptörler için, 1:1000 seyreltmede tavşan anti-GFP antikoru kullanıldı. Endojen GluA1 için, 1:200 seyreltmede fare anti-GluA1 kullanıldı.
- Antikor içeren ortamı bir vakum pipeti kullanarak dikkatlice aspire edin ve hücreleri şartlandırılmış ortamla üç kez yıkayın.
not: Şartlandırılmış ortam mevcut değilse, tüm yıkama adımları PBS + [1 mM MgCl2 ve 0.1 mM CaCl2 içeren fosfat tamponlu salin (PBS)] kullanılarak gerçekleştirilebilir. Nazik vakum aspirasyonu mevcut değilse, bir mikropipet kullanılarak manuel aspirasyon gerçekleştirilebilir.
3. Yüzey İfadesi (Şekil 1)
- Yüzey eksprese reseptörlerinin sekonder antikor etiketlemesi
- PBS+ ile bir kez yıkayın.
- PBS'de %4 paraformaldehit (PFA) ve %4 sükroz ile 7-8 dakika boyunca 7-
inkübe ederek hücreleri sabitleyin
not: Metanol inkübasyonu gibi diğer fiksasyon yöntemlerinden farklı olarak, PFA plazma zarına nüfuz etmez ve bu nedenle yüzey ekspresyonu analizi için uygundur. En iyi sonuçlar için taze hazırlanmış PFA kullanın. PFA'nın 4 °C'de kısa süreli depolanması veya -30 °C'de uzun süreli (20 güne kadar) depolama, yeterli fiksasyon için izin verilir.
Dikkat: PFA bilinen bir kanserojendir. Kullanırken uygun kişisel koruyucu ekipman ve güvenlik başlığı kullanın.
- Hücreleri normal PBS.
ile üç kez yıkayın
not: Alternatif olarak, PBS yerine PFA'yı yıkamak için 0.1 M glisin kullanılabilir, çünkü glisin, preparasyondaki arka planı artırabilecek kalan herhangi bir fiksatifi söndürecektir.
- RT.
'de 30 dakika boyunca PBS'de% 10 normal keçi serumu (NGS) ile inkübe ederek spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke edin.
not: Etiketleme üzerinde olumsuz bir etki yaratmadan engelleme süresi uzatılabilir.
- Birincil antikor etiketli reseptörleri (yani yüzey eksprese edilmiş) etiketlemek için RT'de 1 saat boyunca PBS'de% 3 NGS içinde seyreltilmiş floresan etiketli ikincil antikor ile inkübe edin.
not: Bu örneklerde, Alexa 555 ile konjuge ikincil antikorların 1:500 oranında seyreltilmesi: GFP etiketli reseptörler için keçi anti-tavşan ve GluA1 için keçi anti-fare kullanıldı.
- Hücreleri PBS 3x ile yıkayın.
- Hücre içi reseptörlerin etiketlenmesi
- RT.
'de 5-10 dakika boyunca PBS'de% 0.25 Triton X-100 ile hücreleri geçirgen hale getirin
not: Antikor etiketlemesinin ilk turunun tüm yüzey epitoplarını işgal edip etmediğini kontrol etmek için, bu geçirgenlik adımı bir kardeş kültürde atlanabilir. Bu durumda, hücre içi reseptörler için herhangi bir sinyal elde edilmemelidir. Ek olarak, önceki bölüm 2'de hiçbir iç reseptörün etiketlenmediğini kontrol etmek için (yani, kültürdeki plazma zarlarının bütünlüğünü gösteren), bir kardeş kültürde geçirgenlik aşaması atlanabilir ve hücre içi bir proteine karşı birincil bir antikor (örneğin, postsinaptik yoğunluk proteini 95 [PSD-95] veya mikrotübül ile ilişkili protein 2 [MAP2]) adım 2.2.1'de kullanılabilir. Bu koşullar altında bu primerden sinyal alınmamalıdır. Bu durumda, bir tavşan anti-PSD-95 antikoru (1:500) kullanıldı.
- RT'de 30 dakika boyunca PBS'de %10 NGS ile engelleyin.
- Hücre içi reseptörleri, bölüm 2.2'de kullanılan aynı primer antikorla birlikte, RT.
'de 1 saat boyunca PBS'de% 3 NGS içinde seyreltilmiş aynı birincil antikor ile inkübe ederek etiketleyin
not: Hücre içi reseptörleri etiketlemek için antikor seyreltmesi, yüzey eksprese edilen reseptörleri etiketlemek için gerekenden farklı olabilir. GluA1 örneğinde, aynı antikor seyreltmesi (1:200) kullanılmıştır.
- PBS ile hücreleri 3 kez yıkayın.
- RT.
'de 1 saat boyunca PBS'de% 3 NGS içinde seyreltilmiş ikinci floresan etiketli ikincil antikor ile etiket
not: Bu örneklerde, keçi anti-fare Alexa 647-konjuge ikincil antikorun (GluA1 için) 1:500 seyreltilmesi kullanıldı.
- PBS ile hücreleri 3 kez yıkayın.
4. İçselleştirme (Şekil 2)
- Antikor işaretli yüzey reseptörlerinin içselleştirilmesi
- Yüzey eksprese edilen reseptörlerin etiketlenmesinden ve antikor yıkanmasından sonra (bölüm 2.2), hücreleri antikor içermeyen şartlandırılmış ortamda tutun ve içselleştirmeye izin vermek için inkübatöre (37 °C) geri koyun.
NOT: N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptörleri için içselleştirme için 30 dakika önerilir. Bir kontrol olarak, içselleştirme işlemi sırasında 4 ° C'de şartlandırılmış ortamlarla bir kardeş kültür korunabilir. Bu koşullar altında minimal reseptör içselleştirmesi gerçekleşmelidir.
- Yüzey reseptörlerinin etiketlenmesi
- PBS+ ile hücreleri bir kez yıkayın.
- PBS'de %4 PFA ve %4 sükroz içeren hücreleri 7-8 dakika
sabitleyin
Dikkat: PFA'yı kullanırken uygun kişisel koruyucu ekipman ve bir güvenlik başlığı kullanın.
- Hücreleri normal PBS ile 3 kez yıkayın.
- Spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için RT'de 30 dakika boyunca PBS'de% 10 NGS ile bloklayın.
- Primer antikor etiketli reseptörleri (yani, içselleştirilmemiş yüzey eksprese edilen reseptörler) etiketlemek için PBS'de% 3 NGS içinde seyreltilmiş floresan etiketli ikincil antikor ile numuneleri inkübe edin.
not: Bu örnek için, etiketleme için Alexa 555 konjuge keçi anti-tavşan ikincil antikoru (1:500) kullanıldı.
- PBS ile hücreleri 3 kez yıkayın.
- İçselleştirilmiş reseptörlerin etiketlenmesi
- PBS'de% 0.25 Triton X-100 ile hücreleri 5-10 dakika geçirgenleştirin.
- RT'de 30 dakika boyunca PBS'de% 10 NGS ile inkübasyon ile spesifik olmayan bağlanmayı engelleyin.
- İçselleştirilmiş antikor etiketli reseptörleri etiketlemek için RT'de 1 saat boyunca PBS'de% 3 NGS içinde seyreltilmiş floresan etiketli ikincil antikor ile numuneleri inkübe edin.
not: Bu örnek için, etiketleme için Alexa 647 konjuge keçi tavşan önleyici ikincil antikoru (1:500) kullanılmıştır.
- PBS ile hücreleri 3 kez yıkayın.
5. Geri Dönüşüm (Şekil 3)
- Antikor işaretli yüzey reseptörlerinin içselleştirilmesi
- Yüzey eksprese edilen reseptörlerin etiketlenmesinden ve antikor yıkanmasından sonra (bölüm 2.2), hücreleri antikor içermeyen şartlandırılmış ortamda tutun ve içselleştirmeye izin vermek için inkübatöre (37 °C) geri koyun.
NOT: NMDA reseptörleri için içselleştirme için 30 dakika önerilir.
- Kararlı yüzey eksprese edilen reseptörlerin bloke edilmesi
- İçselleştirilmemiş yüzey eksprese edilen reseptörlere bağlı primer antikor üzerindeki epitopları bloke etmek için, hücreleri konjuge olmayan Fab anti-IgG (H + L) antikor fragmanları (bölüm 2.2'de kullanılan primere karşı) ile inkübe edin, şartlandırılmış ortamda seyreltin (20 μg / mL) RT'de 20 dakika boyunca. Bu tedavi, ikincil antikorlarla gelecekteki etkileşimi önler.
not: Bu örnek için, Keçi anti-tavşan Fab parçaları kullanılmıştır.
not: Kontrol deneyi: Yüzey eksprese edilen reseptörlerin tamamen bloke edildiğinden emin olmak için, kardeş lameller Fab ile ve Fab olmadan inkübe edilebilir. Kültürler Fab tedavisinden hemen sonra düzeltilmelidir ve her iki kültür de Alexa 555 konjuge ikincil antikor ile inkübe edilir. Fab inkübe edilmiş hücrelerde Alexa 555 sinyali olmaması, uygun antikor blokajını gösterir.
- Hücreleri 3 kez şartlandırılmış ortamla yıkayın.
- Daha fazla içselleştirmeyi önlemek için hücreleri 80 μM dynasore içeren şartlandırılmış ortamla inkübe edin ve içselleştirilmiş reseptörlerin geri dönüşümüne izin vermek için hücreleri inkübatöre (37 ° C) geri döndürün. Dynasore, dinamini inhibe eden ve bu nedenle içselleştirmeyi önleyen bir GTPase inhibitörüdür.
NOT: NMDAR geri dönüşümü için 45 dakika tavsiye edilir. Dynasore'un yalnızca dinamine bağlı içselleştirme sürecini (örneğin, NMDAR'ların içselleştirmesi) engellediğini unutmayın. Bununla birlikte, diğer sinaptik proteinlerin (dinaminden bağımsız) içselleştirilmesi, Dynasore'un varlığında hala ortaya çıkabilir.
- Geri dönüştürülmüş reseptörlerin etiketlenmesi
- PBS+ ile hücreleri bir kez yıkayın.
- PBS'de %4 PFA ve %4 sükroz içeren hücreleri 7-8 dakika
sabitleyin
Dikkat: PFA'yı kullanırken uygun kişisel koruyucu ekipman ve bir güvenlik başlığı kullanın.
- PBS ile hücreleri 3 kez yıkayın.
- Spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için RT'de 30 dakika boyunca PBS'de% 10 NGS ile bloklayın.
- RT.
'de 1 saat boyunca PBS'de% 3 NGS içinde seyreltilmiş ilk floresan etiketli ikincil antikor ile hücreleri etiketleyin
not: Bu örnek için, etiketleme için Alexa 555 konjuge keçi anti-tavşan antikoru (1:500) kullanılmıştır.
- PBS.
ile hücreleri 3 kez yıkayın
not: PBS ile daha uzun yıkamalar (5-10 dakika), hazırlıktaki arka planı azaltmaya yardımcı olabilir.
- İçselleştirilmiş reseptörlerin etiketlenmesi
- PBS'de% 0.25 Triton X-100 ile hücreleri 5-10 dakika geçirgenleştirin.
- RT'de 30 dakika boyunca PBS'de %10 NGS ile engelleyin.
- RT.
'de 1 saat boyunca PBS'de% 3 NGS içinde seyreltilmiş ikinci floresan etiketli ikincil antikor ile etiket
not: Bu örnek için, etiketleme için Alexa 647 konjuge keçi tavşan antikoru (1:500) kullanılmıştır.
- PBS ile hücreleri 3 kez yıkayın.
>6. Numunelerin Montajı ve Görüntülenmesi
- Lamelleri uygun montaj ortamının 12–15 μL'si üzerine lamelleri hücre tarafı aşağı bakacak şekilde nazikçe yerleştirerek hücreleri monte edin.
not: Fazla montaj ortamının aspirasyonu, görüntülerin kalitesini artıracaktır.
- Hücreleri uygun bir konfokal mikroskopta görüntüleyin.
not: Nöronun tüm kalınlığını kapsayacak şekilde 0,35 μm'lik adımlarla 60x büyütmede bir z-yığınının görüntülenmesi önerilir.
7. Zamanla İlgili Hususlar
- Bu, birkaç noktada durdurulabilen uzun bir protokoldür. İstenirse, nemli bir odada gece boyunca 4 ° C'de bloke etme ve birincil antikor inkübasyon adımlarını gerçekleştirin.
- Alternatif olarak, istenirse, fiksasyon sonrası inkübasyon sürelerini büyük ölçüde hızlandırmak için bir mikrodalga doku işlemcisi kullanın. Tüm adımlarda, "Açık" ayarlar için 30 °C'de 150 W kullanın.
- Engellemek için işlemciyi 2 dk "Açık", 1 dk "Kapalı" ve 2 dk "Açık" olarak çalıştırın.
- Birincil ve ikincil antikor inkübasyon adımları için, işlemciyi 3 dakika "Açık", 2 dakika "Kapalı" ve 3 dakika "Açık><" olarak çalıştırın.
NOT: Protokolde yukarıdaki değişiklikleri yaparak kalite açısından herhangi bir fark gözlemlemiyoruz.
8. Görüntü Analizi
- Birden fazla dosya formatıyla uyumlu olduğu için görüntü analizi yapmak için FIJI kullanılması önerilir. Verilerimiz için Nikon ND2 dosya formatındaki görüntüler elde edildi.
- FIJI tarafından önceden seçilmiş farklı parametrelerin kolay toplu nicelleştirilmesi için bir makro komut dosyası sağlanır. Aşağıdaki adımlar makroya dahil edilmiştir:
NOT: Bu örnekler için "entegre yoğunluk" ölçülmüştür.
- Görüntü dosyalarını FIJI'de ve ayrı kanallarda açın.
- Z-her kanal yığınını maksimum yoğunluk projeksiyonu olarak yansıtır.
- Her kanal için daha düşük bir eşik ayarlayın.
NOT: Her deneysel veri seti için eşikler ampirik olarak belirlenmelidir. Her kanalın ayrı bir alt eşik değeri olabilirken, aynı veri kümesinin tüm görüntüleri için kanal eşik değerlerinin tutarlı bir şekilde korunması çok önemlidir.
- Üç ila beş ikincil veya üçüncül dendrit seçin ve bunları ilgi bölgeleri (ROI'ler) olarak kaydedin.
- Yüzey ve hücre içi kanallardaki her bir ROI'nin entegre yoğunluğunu ölçün.
- Yüzey kanalının entegre yoğunluk değerini hücre içi kanala bölerek her ROI için sinyali normalleştirin.
- Tüm kontrol ve deneysel görüntüler için ölçümleri tekrarlayın ve deneysel değerleri kontrol değerlerine göre normalleştirin (örneğin, GluN2B WT veya glisin olmayan koşullar).
