Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Hedef Mikroküre hazırlığı
- İlgili bir hedef antijen seçin.
not: Bu örnekte, doğal HIV zarfının trimerik tepesini taklit etmek için tasarlanmış rekombinant protein V1V2-2F5K kullanıldı.
- Üreticinin protokolüne göre ticari bir kit (Malzeme Tablosu) kullanarak biyotinilasyon gerçekleştirin.
- Aşağıdaki formülü kullanarak 5 kat molar fazlalık için reaksiyona eklenecek biyotin reaktifinin mmol'ünü hesaplayın: mmol biotin = mL protein x (mg protein/mL protein) x (mmol biotin/mg protein) x (5 mmol biotin/mmol proteini). Daha sonra aşağıdaki formülü kullanarak eklemek için biyotin reaktifinin μL'sini hesaplayın: μL biotin = mmol biotin x (1.000.000 μL/L) x (L/10 mmol).
- Açmadan önce biyotini oda sıcaklığına dengeleyin. Yukarıda yapılan hesaplamaya göre proteini 0.5−2.0 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözün.
- Dimetilsülfoksit (DMSO) içinde 10 mM'lik bir biyotin reaktif çözeltisi hazırlayın ve protein çözeltisine uygun hacimde 10 mM biyotin reaktifi ekleyin ve reaksiyonu buz üzerinde 2 saat veya oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- Protein yoğunlaştırıcıları (polietersülfon [PES] membranları, 3 kDa moleküler ağırlık kesme [MWCO], 0.5 mL; Malzeme Tablosu) üreticinin talimatlarına göre.
- Numuneyi döndürme kolonunun üst haznesine yerleştirin ve 400 μL'ye kadar PBS ekleyin. Kapak, ardından bu numune haznesini bir toplama tüpüne yerleştirin. Oda sıcaklığında 12.000 x g'da 30 dakika
santrifüjleyin.
- Akışı atın ve PBS'yi 400 μL'ye ekleyin. Santrifüjlemeyi tekrarlayın. Akışı atın ve PBS'yi 100 μL'ye ekleyin. Protein konsantrasyonunu bir spektrofotometre ile ölçün.
not: Protein ayıklanabilir ve kullanılana kadar -80 ° C'de dondurulabilir.
2. Antikora Bağımlı Hücresel Fagositoz (ADCP) Test Plağı Hazırlama
- Biyotinile proteini 1 μm mikrokürelere ('boncuklar'; Malzeme Tablosu) üreticinin talimatlarına göre.
- Konjuge boncuk plakası başına, 6 μg proteini 12 μL stok boncuk ile 200 μL% 0.1 sığır serum albümini (BSA)-PBS içinde oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin ve her 20 dakikada bir hafifçe girdap yapın.
- 5 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın, hafifçe girdap yapın ve 1200 μL% 0.1 BSA-PBS'de yeniden süspanse edin. Sıkma ve yıkama adımını 2x tekrarlayın. 1200 μL'de% 0.1 BSA-PBS'de yeniden süspansiyon edin.
- Yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir plakada oyuk başına 10 μL boncuk çözeltisi alikot. Tipik olarak 50 μg / mL antikor veya 1/100 serum dilüsyonundan başlayarak, 12 μL% 2 HSA HBSS'de ilgilenilen antikor veya immün serumların dilüsyonlarını hazırlayın.
not: Örnek verilerde monoklonal antikor (mAb) 830A kullanıldı.
- Boncuk plakasına 10 μL titre edilmiş antikor / serum ekleyin ve 37 ° C'de 2 saat inkübe edin. Her oyuğa 200 μL% 2 HSA HBSS ekleyin ve 10 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüj plakası
.
- Görünmez boncuk peletini rahatsız etmemek için hızlı bir şekilde ters çevrilerek ve sıvının plaka kuyularından bir lavaboya boşaltılmasıyla süpernatanı dikkatlice çıkarın.
3. Anne sütü hücresi izolasyonu
- Sağlıklı emziren kadınlardan çift elektronik veya manuel pompa kullanılarak ifade edilen anne sütü alın. Sütü oda sıcaklığında tutarak hücreleri ifadeden ~ 4 saat sonra izole edin.
- 50 mL'lik tüpler kullanarak, 50 mL sütü 800 x g'da 15 dakika santrifüjleyin. Hücre peletini rahatsız etmeden bırakırken yağsız süt ve yağı dikkatlice dökün. Tüp duvarındaki tüm yağları çıkarmak için tüpün içini tüy bırakmayan bir mendille silin.
- Hank'in dengeli tuz çözeltisine (% 2 HSA HBSS [Ca2 + veya Mg + olmadan]) 10 mL insan serumu% 2 ekleyin. Hücre aktivasyonunu ve apoptozu önlemek için peleti nazik pipetleme ile yeniden süspanse edin. 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 10 dakika boyunca 450 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı dökün ve adım 1.3'ü tekrarlayın. Daha sonra, beklenen hücre sayısına bağlı olarak hücreleri 1-2 mL% 2 HSA HBSS'de nazikçe yeniden süspanse edin ve hücreleri bir hemositometre veya otomatik bir hücre sayacı ile sayın, ayrıca hücre canlılığına da dikkat edin.
>4. ADCP testi
NOT: Burada açıklanan yöntemler Ackerman et al.'den uyarlanmıştır.
- Her bir ADCP tahlil plakasına 200 μL% 2 HSA-HBSS'de 50.000 taze izole edilmiş BM hücresi ekleyin. 37 °C'de 2 saat inkübe edin.
- Kontrol deneyleri için, hücreleri 37 ° C'de 10 μg / mL aktin inhibitörü (sitokalasin-D), 50 μg / mL Fc reseptör bloke edici ajan (FcBlock) veya plakalara eklenmeden önce her ikisinin bir kombinasyonu ile önceden inkübe edin.
- 10 dakika boyunca 930 x g'da santrifüj plakası. 200 μL% 2 HSA HBSS ekleyin ve santrifüjlemeyi tekrarlayın. Süpernatanı adım 2.7'deki gibi dikkatlice çıkarın ve yıkamayı tekrarlayın.
- 50 μL% 2 HSA HBSS'de oyuk başına 0.5 μg / mL (nihai konsantrasyon) sabitlenebilir canlılık lekesi 450 kullanarak süpernatant ve leke hücrelerini canlılık için dikkatlice çıkarın. Karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Plakayı 10 dakika boyunca 930 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı adım 2.7'deki gibi çıkarın. 200 μL% 2 HSA HBSS ve santrifüj plakasını tekrar ekleyin, ardından adım 2.7'deki gibi süpernatantın çıkarılması.
- Canlı boyama işleminden sonra, optimize edilmiş bir konsantrasyonda (örnek verilerde 50 μL'lik %1 BSA HBSS'de 1 μg/μL) PE-fare anti-insan CD45 (klon HI30) gibi CD45'e özgü bir boyama dahil olmak üzere, ilgilenilen lökosit belirteçleri için hücreleri boyayın.
not: Kökene özgü herhangi bir ilgi belirteci dahil edilebilir.
- Karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Plakayı 10 dakika boyunca 930 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı adım 2.7'deki gibi çıkarın. 200 μL %1 BSA HBSS ekleyin ve santrifüjlemeyi tekrarlayın. Süpernatanı çıkarın. Hücreleri 200 μL% 0.5 formaldehit içinde karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika veya gece boyunca 4 ° C'de sabitleyin. Analiz edilene kadar karanlıkta soğutun.
5. Akış sitometrisi ile analiz
- İleri saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) grafiği ve döküntü (FSC = 5000'den daha küçük malzeme) üzerindeki çiftleri ortadan kaldırmak için ilk geçitleme gerçekleştirin (bkz. Şekil 1). Ölü hücreleri (canlılık lekesi için pozitif olanlar) ortadan kaldırmak için bir SSC ve canlılık lekesi (bu durumda V450) grafiği kullanın.
- Kapsamlı bir şekilde açıklandığı gibi ana lökosit sınıflarını (granülositler, monositler, lenfositler) ayırt etmek için bir SSC ve CD45 grafiği kullanın.
not: Bu sınıflandırma yalnızca düşündürücüdür ve hücre tipini doğrulamak için soya özgü belirteçlere ihtiyaç vardır.
- Tüm CD45 + hücreleri veya ilgilenilen her lökosit alt kümesi için, floresan boncukların algılandığı floresein izotiyosiyanat (FITC) kanalının histogramındaki boncuk pozitif hücreler üzerinde bir işaretleyici ile geçit yaparak ADCP aktivitesini ölçün.
not: Boncukların eklenmediği negatif kontrol kuyuları, boncuk pozitif hücrelerin histogramda nerede göründüğünü ve dolayısıyla geçit işaretleyicisinin nereye yerleştirileceğini gösterecektir.
- ADCP puanlarını (boncuk pozitif hücrelerin medyan floresan yoğunluğu [MFI]) x (pozitif popülasyondaki toplam CD45 + hücrelerin% 'si) olarak hesaplayın. Her Ab/serum konsantrasyonunda skorları çizmek ve eğri altı alan (AUC) analizi yapmak için grafik yazılımı kullanın.
not: AUC, spesifik olmayan bir negatif kontrol mAb'nin (bu durumda, 3865) ADCP skoru AUC'nin standart sapmasının 3x'inden büyükse, ADCP pozitif olarak kabul edilir.
