Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Fare dalağından bağışıklık hücrelerinin hazırlanması
NOT: Saf farelere karbondioksit (CO2) ötenazi ile ötenazi yapın. Jackson Laboratuvarları'ndan satın alınan ve şirket içinde yetiştirilen C57BL/6 fareler, 6-12 haftalıkken deneyler için kullanılır. Deneyler için hem erkek hem de dişi fareler kullanılır.
- Dış kirleticilerin numuneye girme olasılığını azaltmak için fare derisini %70 etanol ile dezenfekte edin.
- Diseksiyon aletleri, cerrahi makas ve forseps kullanarak fare dalağını inceleyin. Dalağı hasat edin ve ayrılmış dalağı, buz üzerinde ~ 5 mL tam Roswell Park Memorial Institute ortamı (cRPMI) bulunan 50 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin.
not: Tam RPMI, %10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L-glutamin ve %1 penisilin/streptomisin'den oluşur.
- Fare dalağını toplamak için, farenin sol tarafı boyunca, ön ve arka bacakların ortasında, kürk ve deriye makasla 5 cm'lik bir kesi yapın. Vücut boşluğunu ~ 5 cm açın ve forseps kullanarak dalağı çıkarın. Dalak, barbunya rengindedir ve komşu böbrekten daha uzun ve düzdür.
- Adım 1.2'nin içeriğini yeni bir 50 mL konik tüpe bağlı steril bir 70 μm filtreye dökün. Filtre yüzeyinde dalak posası kalmayana kadar dalağı 5 mL'lik bir şırınga pistonu ile filtreden iterek dalağı mekanik olarak tek hücreli bir süspansiyona ayırın.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da açılır rotorlu bir tezgah üstü santrifüj kullanarak splenositleri peletleyin.
- Süpernatanı dikkatlice boşaltın. Peletlenmiş splenositler, 50 mL'lik konik tüpün dibinde kalır.
- Kırmızı kan hücrelerini çıkarmak için, peletlenmiş splenositleri üreticinin talimatlarına göre 1 mL amonyum-klorür-potasyum (ACK) lizis tamponunda 3 dakika boyunca yeniden süspanse edin. İyice karıştırın.
- ACK lizis tamponunu 15 mL cRPMI ile söndürün.
- Lenfositleri adım 1.4'te belirtildiği gibi peletleyin.
- Hücre süspansiyonunu 50 mL'lik konik bir tüpte 5 mL cRPMI'de yeniden süspanse edin. Numuneleri buzun üzerine yerleştirin.
- Hücreleri saymak için, 10 μL hücre süspansiyonunu 0.6 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve Tripan mavisi çözeltisi ile 1: 1 oranında seyreltin. Ardından, bir hemositometreye veya otomatik hücre sayma sistemine aktarın.
- Sayma işleminden sonra, adım 1.9'daki gibi hücre süspansiyonundaki hücre konsantrasyonuna bağlı olarak, hücreleri Indo-1 ester boyası içeren cRMPI ortamının eklenmesine hazırlanmak için 5 dakika boyunca 4 ° C'de 500 x g'da bir masa üstü santrifüjde peletleyin.
- 10-12 x 106 hücre / mL elde etmek için hücrelerin yeniden süspansiyon hacmini hesaplayın. Bu, gereken toplam hücre sayısının 2 katı bir konsantrasyondur.
- Adım 1.11'de hesaplanan cRPMI hacmindeki hücreleri yeniden askıya alın. Hücreleri% 5 CO2 ile 37 ° C'de, kapağı havalandırılan 50 mL'lik konik bir tüpe veya bir doku kültürü plakasına yerleştirin.
2. Hint-1 oranlı boya ve floresan antikor etiketleme
- Üreticinin talimatlarına göre, 50 μg Indo-1 içeren bir şişeye 50 μL dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin. Stok çözeltinin konsantrasyonu 1 μg/μL.
'dir
not: DMSO, DMSO'nun herhangi bir oksidasyonunu önlemek için kit ile birlikte mikro şişelerde sağlanır.
- Stok alikotunu (1 μg/μL), 2x konsantrasyon olan 6 μg/mL'lik bir konsantrasyonda cRPMI'nin uygun deneysel hacmine (1.11'de kurulmuştur) seyreltin. Hint-1'i sulu bir çözelti içinde saklamayın.
not: Hücre ihtiyacına bağlı olarak kalsiyum eklenmiş diğer tamponlar kullanılabilir.
- Indo-1 ile tüm ortamı 37 °C'de bir su banyosunda bir kenara koyun.
not: Yeterli bir sinyal elde etmek için gerekli olan minimum Indo-1 ester konsantrasyonunu kullanın. Bunun değişen hücre tipleri için titre edilmesi gerekir. Tipik olarak, 3-5 μM arasında bir konsantrasyon yeterlidir. Birincil T hücreleri için, >5 μg / mL'lik bir konsantrasyonda Indo-1 ile hücrelerin yüklenmesi, spektral akış sitometrelerinde ortalama floresan yoğunluğunu (MFI) 6'lık bir logun üzerine çıkarır. Böyle bir durumda, ultraviyole (UV) lazer yoğunluğunu azaltın ve Indo-1'i daha düşük bir konsantrasyona titre edin.
- Önceden hazırlanmış hücre süspansiyonunu (adım 1.12'de), adım 2.2'de yapılan 2x Indo-1 ortamı da dahil olmak üzere cRPMI'de 1: 1 oranında seyreltin. Hücrelerin 5-6 x 106/mL.
arasında bir konsantrasyonda olduğundan emin olun
not: Indo-1 ile boyasız tek leke kontrolü veya yüzey işaretleyici tek leke hücresi kontrollerini yüklemeyin. Tek lekeli antikor kontrollerine Indo-1'in eklenmesi, tek lekeli hücrelere eklenen Indo-1 nedeniyle çok renkli bir örnek oluşturacaktır. Adım 2.6'da oluşturulan numune plakasına indo-1 (kalsiyum içermeyen) etilen glikol tetraasetik asit (EGTA) eklenmiş kontrolü dahil edin.
- 12 oyuklu bir doku kültürü plakasına 1 mL hücre / kuyu / deneysel koşul ekleyin.
- Daha önce Indo-1 boya yüklü hücreleri kullanarak Indo-1 (kalsiyum içermeyen) numune için tek bir lekeli kontrol oluşturun ve EGTA'yı 2 mM'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. EGTA, hücre süspansiyonundaki kalsiyumu şelatlayarak daha temiz bir kontrol numunesi verir.
- Akış sitometresinde boya yüklü hücre süspansiyonuna 50 μM iyonomisin ekleyerek bir Indo-1 pozitif kontrolü (Indo-1 kalsiyuma bağlı) oluşturun. İyonomisin, kalsiyum iyonlarını bağlayan ve kalsiyum iyonlarının hücrelere transferini kolaylaştıran zar geçirgen bir kalsiyum iyonoforudur.
- Florofor veya Indo-1 boyası içermeyen biyolojik negatif kontrol için bir kuyu oluşturun.
- Bir akış sitometrisi paneli tasarımında antikor konjuge floroforları kullanarak, ilgilenilen herhangi bir ek hücre popülasyonu (kullanıcı tanımlı antikorlar) için tek leke kontrolleri için bir kuyu oluşturun. Bunlara Hint-1 oranlı boya dahil edilmeyecektir.
- Yüzey boyama için ek florokrom konjuge antikorlar eklemeden önce, üreticinin talimatlarına göre Fc reseptör bloke edici antikoru (~ 2 μg / 1 x 106 hücre) ekleyin.
- Plakayı 37 ° C'de% 5 CO 2 ile 45 dakika inkübe edin.
- Her 15 dakikada bir plakaya hafifçe vurarak hücreleri 12 oyuklu bir plakada yeniden süspanse edin.
- Ortamda asılı kalan hücrelerin tüm hacmini 12 oyuklu plakadan karıştırın ve çıkarın. Daha sonra hücre süspansiyonunu 1.7 mL mikrosantrifüj tüplerine ekleyin.
- Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g'da bir mikrosantrifüjde peletleyin. Süpernatanı boşaltın ve 1 mL önceden ısıtılmış cRPMI ekleyerek hücreleri yıkayın. Tekrar pelet yapın ve süpernatanı boşaltın.
not: Hücrelerin yıkanması, kalan Fc bloke edici antikoru ortadan kaldırır.
- Hücreleri 1.7 mL mikrosantrifüj tüplerinde 1 mL cRPMI'de yeniden süspanse edin ve her tüpü 37 ° C'de% 5 CO2'de 30 dakika daha inkübe edin, tüpün üst kısmını gaz değişimine izin vermek için hafifçe açık bırakın. Bu, hücre içi esterlerinin tamamen de-esterleşmesine izin verir.
- Gerekirse, hücreleri 12 oyuklu bir doku kültürü plakasına geri aktarın. Ek kullanıcı tanımlı titre edilmiş florokrom-konjuge antikorlar bir dinlenme fazında eklenebilir.
not: Yöntemler panelinde kullanılan belirteçler şunları içerir: Ghost 540, CD4, CD8, TCRβ, TCRγδ, CD25 ve CD1d/α-galser tetramer. T hücresi alt kümelerini analiz etmek için belirteçler seçilir.
- Daha önce titre edilmiş bir hacimde 1.7 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne ilgilenilen hücre tiplerine göre tüm kullanıcı tanımlı florokrom konjuge antikorların bir ana karışımını oluşturun.
- Dinlenme hücrelerine titre edilmiş antikorlara bağlı olarak hücre hacminin 1 mL'si için hesaplanmış bir ana karışım ekleyin.
not: Sonraki adım 2.18 yerine adım 2.15'te boyamanın avantajı, adım 2.15'te boyamanın deney için genel inkübasyon süresini azaltmasıdır. Bununla birlikte, adım 2.15'te toplam 1 mL hacimde boyama, antikor kullanımını artırır.
- Dinlendikten sonra, hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g'da peletleyin.
not: 12 oyuklu bir doku kültürü plakasındaki hücreler, bir plaka santrifüj aksesuarı ile plaka içinde peletlenebilir. Aksi takdirde, hücreleri 1.7 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde peletleyin.
- Peleti 1 mL 4 °C soğuk cRPMI'de yeniden süspanse ederek hücreleri yıkayın ve hücreleri adım 2.16'daki gibi tekrar pelet haline getirin. Hücreleri buzun üzerine yerleştirin.
not: Yüzey boyama hücreleri ayrı ayrı, adım 2.18'de de-esterifikasyon sonrası, daha az antikor hacmine ihtiyaç duyulur. Bu aşamada yüzey boyama, dinlenme aşamasından sonra soğuk akış tamponunda (1x Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS)% 1 FBS ile), kullanıcı tanımlı antikorlar kullanılarak, 30 dakika boyunca buz üzerinde gerçekleştirilebilir. Lekeden sonra hücreleri adım 2.17'deki gibi cRPMI'de yıkayın.
- DPBS'de 1:7.500 oranında seyreltilmiş canlılık lekesi Ghost540'ı üreticinin talimatlarına göre numunelere ekleyin. Isı, tek lekeli canlı/ölü kontrolü için bir ısınma bloğunda hücreleri 55 °C'de öldürür.
not: Canlılık fonksiyonel boya boyama, akışta ölü hücreleri ortadan kaldırmak için sitometrik analiz FBS olmadan gerçekleştirilir. FBS, üreticinin talimatlarına göre amin boyaları ile etkileşime girebilir.
- Kapaklı 5 mL polistiren akış tüpü kullanarak tek tek numuneleri 500 μL cRPMI'de (fenol kırmızısı içermeyen) yeniden süspanse edin.
not: Hücreler 4 °C'de bir saate kadar bırakılabilir.
- Akış sitometresindeki analizden önce 7 dakika boyunca bir boncuk banyosu kullanarak hücre içeren her 5 mL'lik tüpü ayrı ayrı 37 ° C'ye ısıtın ve numuneler arasında süreyi tutarlı tutun. Bir zamanlayıcı kullanın.
>3. Boncuk banyosu tüpü: kalsiyum akısı analizi sırasında sıcaklığın korunması
- Su eklenmemiş küçük bir su banyosuna banyo boncukları ekleyin; 37 ° C'ye kadar ısıtın.
- 50 mL'lik konik bir tüpü 25 mL işaretinde, bir tıraş bıçağıyla dikkatlice ikiye bölün; tüpün üst kısmını atın.
- Yarıya bölünmüş tüpün 3/4'ünü banyo boncukları ile doldurun.
- Adım 3.2'de oluşturulan tüpü adım 3.1'de oluşturulan boncuk banyosuna yerleştirin. Tüpü ve boncukları 37 °C'ye getirin.
- Numune analizine hazırlanırken sıcaklığı korumak için boncuk banyosunu akış sitometresinin yanındaki bir elektrik prizine takın.
- Akış sitometresi üzerinde çalışırken tüpü yerine yerleştirmek için bir tüpü tutmak için 50 mL'lik bir konik strafor raf kesimi ekleyin. Bu, eğri analizi süresince tüpü manuel olarak tutma ihtiyacını ortadan kaldıracaktır.
