1. VLP-bakteri Bağlanma Testi
>DİKKAT: İnsan norovirüs VLP'leri bir biyogüvenlik seviyesi (BSL)-2 tehlikesidir ve VLP'leri içeren tüm çalışmalar bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir. Ataşman tahlili öncesi bakteri kültürlerinin hazırlanması, organizma için uygun güvenlik koşulları kullanılarak yapılmalıdır.
- Reaktif hazırlama
- 1x fosfat tamponlu salin (PBS)
- Bir paketi 1 L deiyonize (DI) suda çözerek 1 L 10x PBS hazırlayın.
- 30 dakika boyunca otoklav çözeltisi.
- Yukarıdaki çözeltiyi 1:10 oranında DI suda seyrelterek 1x çözelti hazırlayın.
- Filtre, çözeltiyi 0.22 μm'lik bir filtreden geçirerek ve oda sıcaklığında saklayarak sterilize eder.
- %5 BSA
- % 5 (a / h) bir çözelti oluşturmak için 100 mL PBS'ye 5 g sığır serum albümini (BSA) tozu ekleyin.
- Çözeltiyi, topaklar çözülene kadar bir karıştırma plakası üzerinde girdaplayarak veya metal bir karıştırma çubuğu kullanarak karıştırın.
- Filtre, 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak sterilize edilir.
- Solüsyonu 4 °C'de saklayın.
- Akış sitometrisi leke tamponu (FCSB)
- Satın alınan FCSB'yi (Malzeme Tablosuna bakınız) 0,22 μm'lik bir filtreden geçirin.
- Kalan çözeltiyi 4 °C'de saklayın.
- %5 Blokaj Tamponu (BB)
not: Her seferinde taze hazırlayın.
- 10 mL steril FCSB'ye 0.5 g BSA ekleyin.
- Numuneyi iyice karıştırmak için girdap yapın ve kullanana kadar buz üzerinde bırakın.
- Antikor konjugasyonu
- Üreticinin talimatlarına göre bir R-PE antikor etiketleme kiti kullanarak r-fikoeritrin (PE) ile insan norovirüs GII antikorunu (Malzeme Tablosuna bakınız) konjuge edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Konjuge antikoru, ileride VLP-bakteri bağlanma tahlil analizinde kullanılmak üzere karanlıkta 4 °C'de saklayın.
not: Akış sitometrisi analizi için gerekli uygun konsantrasyonu belirlemek için VLP-bakteri bağlanma testinde kullanılmadan önce birincil antikor titre edilmelidir. Konjugasyon reaksiyonu her gerçekleştirildiğinde ve ek testinde kullanılan her bakteri için antikor titrasyonu yapılmalıdır.
- Antikor titrasyonu
- Konjuge anti-insan norovirüs GII antikorunu, 1:100'lük bir başlangıç seyreltmesi ve 1:600'lük bir bitiş seyreltmesi (toplamda altı seyreltme) ile 100 kat seyreltin.
- Aşağıdaki istisna dışında aşağıda açıklandığı gibi bir virüs bağlanma testi gerçekleştirin: adım 1.5.7'de, bakteri peletini 350 μL% 5 BB'de yeniden süspanse edin.
- Numuneyi yedi adet 50 μL'lik alikota bölün.
- Bir tüpe her antikor seyreltmesinden 50 μL ekleyin.
- Lekesiz bir kontrol olarak yedinci tüpe 50 μL% 5 BB ekleyin.
- Aşağıda açıklandığı gibi tüm numuneler üzerinde akış sitometrisi gerçekleştirin.
- Seyreltilmiş antikor örneklerini boyanmamış kontrollerle ve birbirleriyle karşılaştırın. Sonraki testler için pozitif sinyalin azalmasına veya kaybına neden olmayan en düşük antikor konsantrasyonu seçilmelidir.
- Bakterilerin hazırlanması
- Bakterileri sabit faza gelene kadar uygun atmosferik koşullar altında 40 mL uygun sıvı ortamda büyütün.
- Enterobacter cloacae kültürlerini gece boyunca Luria Broth'ta 37 ° C'de aerobik olarak büyütün, durağan faza ulaşmak için 200 rpm'de çalkalayın.
- De Man, Rogosa ve Sharpe (MRS) et suyunda Lactobacillus gasseri kültürlerini 18 saat boyunca 37 °C'ye ayarlanmış bir su banyosunda çalkalamadan siyah vidalı kapaklı tüplerde büyütün ve durağan faza ulaşın.
- Sabit faz kültürlerini 50 mL konik tüpleri temizlemek için aktarın ve bakterileri peletlemek için numuneleri 2.288 x g'da 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
- Süpernatanı çıkarın ve 13 mL steril 1x PBS'de yeniden süspanse edin. Bu yıkama adımını toplam iki yıkama için tekrarlayın.
- Numuneleri tekrar santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve numuneleri 20 mL 1x PBS.
içinde yeniden süspanse edin
not: Hücre peleti küçükse, yeniden süspansiyon hacmi azaltılabilir.
- Kültürün OD600'ünü ölçün.
- Standart bir eğri kullanarak, yıkanan kültürün mL başına koloni oluşturan birimini (CFU) belirleyin.
- Kültür konsantrasyonunu 1 x 108 CFU / mL'ye ayarlamak için bakterileri 1x PBS ile seyreltin.
- 1 x 108 CFU/mL bakteri kültürünün 1 mL'sini gerekli 1.5 mL santrifüj tüplerine aktarın.
- Tüpleri 5 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin.
- Bakteri peletini 1 mL steril% 5 BSA içinde yeniden süspanse edin.
- Tüpleri sabit dönüşle 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
- Virüs eki
- Bir BSL-2 biyogüvenlik kabini içinde çalışarak, PBS'de yeniden süspanse edilmiş bakterileri içeren her tüpe 10 μg insan norovirüsü (HuNoV) VLP'leri (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın.
not: VLP konsantrasyonu her VLP preparatına göre farklılık gösterir. Bu nedenle, bakterilere eklenen hacim, hazırlama partileri arasında değişecektir ve deneydeki her tüpe 10 μg eklenecek şekilde buna göre ayarlanmalıdır. Yalnızca bakteri içeren kontroller için (örneğin, VLP'siz numuneler), deneysel numunelere eklenen VLP hacmine eşit bir PBS hacmi ekleyin.
- Tüpleri sabit dönüşle 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
NOT: İnkübasyon sırasında 40 rpm'ye ayarlanmış bir tüp tabanca (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılır.
- İnkübasyondan sonra, numuneleri 5 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve bakteri peletini 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin.
- 1.5.3 ve 1.5.4 yıkama adımlarını tekrarlayın.
- Numuneleri 10.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve bakteri peletini 150 μL% 5 BB içinde yeniden süspanse edin.
- Antikor boyama
- Taze %5 BB.
hazırlayın
NOT: Floresan etiketli antikor kullanılarak yapılan tüm çalışmalar karanlıkta yapılmalı ve antikor, BB ve FCSB buz üzerinde tutulmalıdır.
- İnsan norovirüs GII antikoru E. cloacae örnekleri için 1:125 ve L. gasseri örnekleri için 1:150'yi %5 BB'de seyreltin, örnek başına 50 μL seyreltilmiş antikor hazırlayın.
- İzotip antikorunu, insan norovirüs GII antikorunun% 5 BB'deki her bakteri için seyreltildiği şekilde seyreltin ve numune başına 50 μL seyreltilmiş izotip kontrolü hazırlayın.
- Adım 1.3.7'deki her bir ek tahlil örneğini, temiz 1.5 mL santrifüj tüplerine aktararak üç adet 50 μL'lik alikotlara bölün.
- İlk numune setine 50 μL BB ekleyin. Bu set, lekesiz (Uns) kontroller olacaktır.
- İkinci sete 50 μL GII antikor seyreltmesi ekleyin. Bu, E. cloacae için 1:250 ve L. gasseri için 1:300'lük bir nihai antikor konsantrasyonu ile sonuçlanır. Bu numune seti lekeli (AB) numuneler olacaktır.
- Üçüncü sete 50 μL seyreltilmiş izotip antikor ekleyin. Bu set izotip kontrolleri (IC) olacaktır. Pipetleyerek iyice karıştırın. Numuneleri buz üzerinde ve karanlıkta 30 dakika inkübe edin.
- Tüm numuneleri 10.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve numuneleri 100 μL FCSB'de yeniden süspanse edin.
- Tüm numuneleri 5 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve numuneleri 100 μL FCSB'de yeniden süspanse edin.
- Tüm numuneleri 10.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve numuneleri 150 μL FCSB'de yeniden süspanse edin.
- Her numuneyi, toplam 550 μL hacim için 400 μL FCSB tamponu içeren bir FCSB tüpüne aktarın.
- Numuneleri akış sitometrisi ile analiz edilene kadar 4 °C'de tutun.
not: Akış sitometrisi, antikor boyamasından sonraki 4 saat içinde gerçekleştirilir.
