Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması
NOT: Tüm numuneleri üreticinin yönergelerine göre hazırlayın. Bu prosedür sırasında kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlükleri, eldivenler ve gözlükler) kullanın.
- 0.941 g sükroz (11 mM nihai konsantrasyon), 6.4 mL 5 M sodyum klorür (NaCl, 128 mM final), 5.4 mL 0.2 M monosodyum fosfat (NaH2PO4, 4.3 mM final), 9.4 mL 0.2 M disodyum fosfat (Na2HPO4, 7.5 mM final), 0.352 g sodyum sitrat (4.8 mM final), ve 0.115 g sitrik asit (2.4 mM final). ddH2O ile toplam hacmi 250 mL'ye ayarlayın. 0,45 μm'lik bir filtre diskinden süzün ve pH'ı 6,5'e ayarlayın. 4 °C'de 1 yıla kadar saklayın. Kullanmadan önce çözeltiyi oda sıcaklığına (RT) getirin.
- 250 mM sükroz, 1 mM etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) ve 10 mM Tris (hidroksimetil) aminometan hidroklorürü (Tris-Cl, pH 7.4) 100 mL'lik bir nihai hacimde birleştirerek yırtılma tamponunu hazırlayın. 4 ° C'de 1 yıla kadar saklayın. 2 mL yırtılma tamponuna 2 μL fosfataz inhibitörleri kokteyli (1:1000 final) ve 1 μL proteaz inhibitörleri kokteyli (1:2000 final) ekleyin. Kullanana kadar buz üzerinde tutun. Kullanılmayan yırtılma tamponunu atın.
2. Trombosit izolasyonu
- Asit-sitrat-dekstroz (ACD) çözeltisi (75 mM trisodyum sitrat, 124 mM dekstroz ve 38 mM sitrik asit, pH = 7.4; ACD: kan = 1:9). Tüp içeriğini 5x–6x elle ters çevirerek nazikçe karıştırın.
- Tüpleri RT'de 20 dakika boyunca sallanan bir kova rotorunda 200 x g'da santrifüjleyin.
- Trombositten zengin plazmayı (PRP) (~ 3-4 mL) 15 mL'lik konik tabanlı bir tüpe toplayın ve kontaminasyonu önlemek için PRP'nin yaklaşık 0,5 mL'sini buffy coat (puslu görünümlü fraksiyon) boyunca bırakın. Herhangi bir kırmızı kan hücresi kontaminasyonu meydana gelirse, bu adımı tekrarlayın.
- PRP örneklerini RT'de 15 dakika boyunca 1.200 x g'da santrifüjleyin.
- Trombosit peletlerini (P1) 1 mL sitrat yıkama tamponunda nazikçe yeniden süspansiyon halinde yıkayın ve peleti RT'de 15 dakika boyunca 1.200 x g'da santrifüjleme ile yıkayın.
- Saf trombosit peletini saklayın. Süpernatanı atın.
- Trombosit peletlerini, inhibitör kokteylleri içeren yırtılma tamponunun 600 μL'sinde yeniden süspanse edin.
- Bir sonikatör kullanarak trombosit süspansiyonunu sonikleştirin. Numuneyi mini bir buz kovasına yerleştirin. Sonikatörü sürekli modda 3 s için 20 ayarına ayarlayın.
NOT: Probu çamaşır suyu ve ardından damıtılmış su ile temizleyin.
- Membranöz fraksiyonları çıkarmak için sonikasyonlu numuneleri 20.000 x g'de 4 ° C'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanları 60 μL'de alikotlayın ve -80 °C'de saklayın. Trombosit sitozolik fraksiyonları için tekrarlanan çözülme / donma döngülerinden kaçının.
3. Kılcal elektroforez immünoassay (CEI) için hazırlık
NOT: ALS hastalarından (n = 8-10) 100 μL insan trombosit lizatı birleştirildi ve sağlıklı denekler (n = 8-10) ayrı ayrı toplandı ve test optimizasyonu için kullanıldı.
- CEI düzeni (Tablo 1) ve numune hazırlama (Tablo 2) için şirket içi oluşturulan şablonları doldurun. Numune karışım hazırlama tablosu dinamiktir ve kaynaktan ne kadar hacim çıkarılması gerektiğini otomatik olarak hesaplar.
NOT: Dinamik Tablo 2'ye gerekli kaynak hacmi girildiğinde, 0.1 X örnek tampon hacmi otomatik olarak hesaplanacaktır.
- 25 adet 0.2 mL PCR tüpünü kılcal damarlar #1–#25 ile önceden etiketleyin ve bir PCR rafına yerleştirin. Buz üzerine ayarlayın.
- 0.6 mL mikrosantrifüj tüplerini önceden etiketleyin: kullanılacak her birincil antikor ve seyreltme (gerekirse) için bir tane, 0.1x numune tamponu için bir tane, luminol-S/peroksit için bir tane ve seyreltilecek her numune için bir tane (gerekirse). Onları bir tüp rafındaki buzun üzerine yerleştirin.
- CEI ayırma 12–230 kDa ana kit ayırma modülünde sağlanan numune tamponunu, yıkama tamponunu, bir plakayı ve bir kartuşu çıkarın.
- 4 °C buzdolabından antikor seyreltme tamponunu, birincil antikorları, ikincil antikorları, luminolü, hidrojen peroksiti ve standart paketi çıkarın. RT.
'da kalan standart paket dışındaki tüm reaktifleri buzun üzerine yerleştirin.
NOT: Standart paketlerdeki reaktifler liyofilize edilir ve bir folyo kapakla kapatılır. Ürün kaybını azaltmak için, bunlar açılmadan önce bir mini santrifüj kullanılarak kısa bir süre döndürülmelidir. Açmak için, reaktif tüpleri bir pipet ucu ile delinebilir veya köşeden geri çekilebilir.
- 400 mM ditiyotreitol'ü (DTT) hazırlamak için, DTT'yi içeren berrak tüpe 40 μL deiyonize su ekleyin.
- 40 μL floresan 5x ana karışım hazırlamak için, kitte verilen pembe tüpe 20 μL 10x numune tamponu ve 20 μL hazırlanan 400 mM DTT solüsyonu ekleyin.
- Biyotinillenmiş merdiveni hazırlamak için, kitte verilen beyaz tüpe 16 μL deiyonize su, 2 μL 10x numune tamponu ve 2 μL hazırlanan 400 mM DTT solüsyonu ekleyin. Nazikçe karıştırın ve denatüre etmek için 0.2 mL'lik bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüpüne aktarın.
- 0,6 mL'lik bir mikro santrifüj tüpüne 1,5 μL 10x numune tamponu ve 148,5 μL deiyonize su ekleyerek 0,1x numune tamponu hazırlayın. Karıştırmak ve buzun üzerine yerleştirmek için girdap.
- İstenilen antikor seyreltmelerini hazırlayın. Önceden etiketlenmiş her bir mikro santrifüj tüpüne belirlenmiş hacimlerde antikor seyreltici ekleyin. Hacimler aynıysa, ters pipetleme tekniğini kullanın; Değilse, dağıtmadan önce pipet ucunu önceden durulayın.
NOT: Bu testte A-TDP-43 pan antikoru ve a-p(S409/410-2) TDP-43 antikoru kullanıldı. Test bileşenlerinin çalıştığından emin olmak için dahili kontrol için anti-ERK antikoru kullanıldı.
- Antikor seyreltmesi için ters pipetlemeyi aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirin. Alternatif olarak, literatürde ek bilgiler bulunabilir.
NOT: Küçük ardışık hacimlerde çözeltiler dağıtılırken ters pipetleme tercih edilir. Bu teknik bazı avantajlar sunar: (i) kesin bir hacim sağlamak, (ii) uç deliğindeki reaktif köpürmesini ortadan kaldırmak ve (iii) küçük hacimli (<5 μL) reaktifler, viskoz çözeltiler, yüzey aktif madde çözeltileri ve yüksek buhar basıncına sahip çözeltiler için idealdir.
- Bir pipete uygun bir uç koyun ve pistonu ikinci durağa kadar bastırın (Adım 2). Pipet ucunu solüsyona birkaç milimetre daldırın. Uç hala daldırıkken pipet ucunu solüsyonla doldurmak için pistonu yavaşça serbest bırakın. Ucu solüsyondan çıkarın ve ucun dışında kalan fazla sıvının çıkarılması için reaktif rezervuarının kenarına hafifçe dokunun.
- Pistonu ilk durdurmaya kadar bastırarak çözeltiyi dağıtın (Adım 1). Uçta kalan çözeltiyi dağıtmayın.
- Pistonu ikinci durdurucuya kadar bastırarak uçta kalan çözeltiyi reaktif haznesine boşaltın (Adım 2). Bir sonraki pipetleme adımı için pistonu hazır konuma getirin.
- Gerekli antikoru, önceden etiketlenmiş her bir mikrosantrifüj tüpüne belirlenen hacimlerde ekleyin (Tablo 1). Pipet ucunu önceden durulamayın: doğrudan seyrelticiye ekleyin ve antikoru çıkarmak için ucu birkaç kez yıkayın. Tüpleri buzun üzerine yerleştirin.
- CEI numune karışımını hazırlamak için, kapak # 2 ile kapak # 25 arasında etiketlenmiş PCR tüpleri için aşağıda listelenen adımları gerçekleştirin: Bu, Tablo 1'deki ile aynı sıradadır.
- Tüm tüpleri açın, ters pipetleme tekniği kullanarak her tüpe 1,6 μL floresan 5x numune tamponu ekleyin, ardından numune kaybını en aza indirmek için 5x tamponun eklenmesinin ardından her bir PCR tüpünü kapatın.
- Tüm tüpleri açın, her tüpe Tablo 2'de belirtilen hacimlerde 0,1x numune tamponu ekleyin ve hemen ardından kapatın. Hacimler aynıysa, ters pipetleme tekniği kullanın. Değilse, 0.1x numune tamponunu dağıtmadan önce pipet ucunu önceden durulayın.
- Tüm tüpleri açın, her tüpe Tablo 2'de belirtilen hacimlerde protein örneği ekleyin ve hemen ardından kapatın. Hacimler aynıysa, ters pipetleme tekniğini kullanın. Değilse, 0.1x numune tamponunu dağıtmadan önce pipet ucunu önceden durulayın.
- Tüm PCR tüplerini bir tezgah üstü santrifüjde (30 saniye boyunca 13.000 x g) kısaca santrifüjleyin, PCR tüplerini karıştırmak için hafifçe vurun/vorteksleyin, ardından santrifüjlemeyi tekrarlayın.
- Tüm PCR tüplerini ısıtılmış kapaklı bir termocycler'a aktarın. Numuneleri tanımlanmış sıcaklık ve sürede denatüre edin (yani, 5 dakika boyunca 95 °C; 10 dakika boyunca 70 °C).
NOT: Denatürasyon sıcaklığı ve süresi hedef protein için optimize edilmelidir.
- 3.12.4 adımını tekrarlayın.
- Tüm PCR tüplerini tüp rafına geri koyun ve buzun üzerine yerleştirin.
- Denatüre etme adımı sırasında, geliştirme solüsyonunu (1:1 luminol-S: peroksit solüsyonu) hazırlayın, ardından 200 μL luminol-S ve 200 μL peroksit ekleyin. Buzun üzerine yerleştirin.
- Yukarıda hazırlanan numune ile önceden doldurulmuş bir CEI plakasını yüklemek için, reaktifleri ve numuneleri tahlil düzeninde gösterilen tahlil plakasına dağıtın (Şekil 1). Hava kabarcıkları sokmaktan kaçının.
NOT: Hacimler ve çözelti aynıysa, ters pipetleme tekniği kullanın. Değilse, dağıtmadan önce pipet ucunu önceden durulayın ve kalanını pipet üzerindeki ikinci tırnaklı durdurucuyu kullanarak plakaya iyice atmayın. 12–230 kDa'lık bir ayırma modülü, renk kodlu bir plaka yükleme kılavuzu içerebilir. Kuyuya reaktifler ve numuneler eklerken bu kılavuzu plakanın altına yerleştirin, bu da numune yükleme sırasında görsel olarak yardımcı olur. Plaka yükleme kılavuzu şirketin web sitesinden de indirilebilir.
- 15 μL luminol ekleyin: E sırasındaki her bir kuyucuğa peroksit karışımı.
NOT: İdeal olarak, bu reaktifi kullanmadan hemen önce hazırlayın ve her bir oyuğa ekleyin. Bu uygun değilse, bu karışım plaka yüklemeden en fazla 30 dakika önce hazırlanabilir.
- D satırında, D1 kuyusuna 10 μL streptavidin-HRP ekleyin.
- D satırında, D2-D25 kuyularına 10 μL belirlenmiş ikincil antikor ekleyin.
- B satırında, her bir oyuğa 10 μL antikor seyreltici ekleyin.
- C satırında, C1 kuyusuna 10 μL antikor seyreltici ekleyin.
- C satırında, C2-C25 kuyularına 10 μL belirlenmiş primer antikor ekleyin.
- A satırında, A1 kuyusuna, PCR tüpü #1'den 5 μL biyotinile merdiven ekleyin.
- A satırında, A2–A25 kuyularına, 3 μL numuneyi, PCR tüpleri #2–#25'i karşılık gelen kuyucuk #2–#25'e ekleyin.
- Belirlenen her yıkama tamponu kuyucuğuna 500 μL yıkama tamponu ekleyin.
- Plakayı RT'de 1.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
Tablo 1: CEI tahlil plakası yükleme şablonu.
Tablo 2: Etkileşimli örnek karışım hazırlama şablonu. Bilinmeyen numunelerden stok protein konsantrasyonu girildikten sonra, etkileşimli hücreler numune karışımını hazırlamak için ne kadar hacim kullanılması gerektiğini otomatik olarak hesaplayacaktır.
