Mikroakışkan Bir Cihaz Kullanan Manyetik Nanopartikül Bazlı Bir İmmünoassay

Özet

Kaynak: Hernández-Ortiz, J. A., et al. Manyetik Nanopartikül Tabanlı İmmünoanalizler için Kademeli Kısıtlamalı Bir Mikroakışkan Akrilik Cihazın Bilgisayarlı Sayısal Kontrol Mikro frezelemesi. J. Vis. Uzm. (2022).

Bu video, manyetik nanoparçacık tabanlı bir immünolojik test için bir mikroakışkan sistemi göstermektedir. Algılama sistemi, kanalları içinde manyetik bir tuzak içeren bir mikroakışkan cihaz kullanır. Primer ve peroksidaz konjuge sekonder antikorlara bağlı antijen kaplı manyetik nanopartiküllerden oluşan önceden oluşturulmuş immünokompleksler kanallara sokulur. İmmünokompleksler, harici bir manyetik alan uygulandıktan sonra gözenekli manyetik tuzakta yakalanır. Peroksidazlar tarafından kataliz üzerine floresan yayan florojenik bir substrat kullanılarak, yakalanan immünokompleksler mikroskop altında tespit edilir.

Protokol

1. Cihaz hazırlığı

1. Kanalları bir şırınga kullanarak damıtılmış suyla doldurun. Sızıntı veya akışa karşı direnç olmadığından emin olun. Kanalların içinde kalan akrilik, yapışkan veya istenmeyen malzemeleri çıkarmak için cihazı 10 dakika boyunca ultrasonik banyoya daldırın.
2. Cihaz kanallarının içindeki suyu boşaltın. % 5 (a / h) sığır serum albümini (BSA) ile hazırlanan, 1x Tris tamponlu salin (TBS) içinde seyreltilmiş ve daha önce 0.2 μm polietersülfon (PES) şırınga filtresinden süzülmüş bir bloke edici çözelti eklemek için bir şırınga kullanın.
3. %5 BSA.
   içinde 7,5 μm çapında demir mikropartiküllerden oluşan bir süspansiyon hazırlayın not: Mikropartiküller daha önce protein emilimine direnç sağlayan bir silika-polietilen glikol (PEG) tabakası ile işlevselleştirilmişti.
4. Çipi ve mikropartikül süspansiyonunu oda sıcaklığında en az 1 saat boyunca bloke edici çözelti ile inkübe edin. Mümkünse, gece boyunca 4 °C'de engellemeye izin verin.

2. Mikropartikül tuzağı oluşumu

1. Mikropartikülleri yan kanal çıkış hortumundan bir şırınga iğnesi ile çipin içine yerleştirin. Çipi dikey olarak yerleştirin ve mikropartiküllerin yerçekimi etkisi altında yan kanaldan akmasına izin verin. Çipi 90°'lik iki adımda 180° döndürün ve mikropartiküllerin 5 μm kısıtlamasında hedeflemesine ve sıkışmasına izin verin.
2. Yerçekimi ile yan kanala doğru 45° döndürerek fazla mikropartikülleri çıkarın.
3. Mikropartikül tuzağının çözülmesini önlemek için cihazı dik tutun. Mikropartikül tuzağı oluşum sürecinin bir özeti için Şekil 1B'ye bakın.

3. İmmünoassay

1. Nanopartikül hazırlama
   1. Daha önce lizozim (antijen modeli) ile konjuge edilmiş 100 nm nanopartiküllerin süspansiyonunun 2 μL'sini alın. 100 μL bloke edici çözelti içeren 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
   2. 150 μL yıkama tamponu ekleyin (1x TBS, %0,05 Tween 20).
   3. 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünü manyetik bir ayırıcıya yerleştirin. Nanopartiküllerin ayrılmasına izin vermek için 15 dakika saklayın (Şekil 2).
      not: Manyetik ayırıcı için minimum hacim 200 μL'dir. Daha küçük bir hacim kullanmaktan kaçının.
   4. Sıvıyı bir mikropipet ile tüpten çıkarın. Nanopartikül peletinin oluştuğu tüpün duvarı ile temastan kaçının.
   5. 250 μL taze yıkama tamponu ekleyin. Tüpü 15 dakika çalkalayın.
   6. 3.1.3.-3.1.5 adımlarını tekrarlayın. 2 kat daha fazla, sadece 5 dakika sallayın.
   7. İstenilen konsantrasyonda primer anti-lizozim antikoru ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). Antikor seyrelticide 100 μL'lik bir son hacme ayarlayın (1x TBS, %1 BSA, %0.05 Tween 20).
   8. 37 °C'de 15 dakika inkübe edin. Oda sıcaklığında 15 dakika daha çalkalamaya devam edin.
   9. 3.1.2.-3.1.6 yıkama adımlarını tekrarlayın.
   10. 100 μL antikor seyreltici ekleyin. Yaban turpu peroksidaz bağlı ikincil antikoru (HRP-AbII) (Malzeme Tablosuna bakınız) 1:500 seyreltmede ekleyin.
   11. 3.1.2.-3.1.6 yıkama adımlarını tekrarlayın.
   12. Nanopartikülleri 50 μL antikor seyrelticisinin son hacminde tutun.

4. Deneysel montaj

1. İki adet 100 μL'lik cam şırıngayı suyla doldurun, her şırıngaya 6,5 cm uzunluğunda bir hortum bağlayın, hortumun ucuna metal bir pim yerleştirin ve her iki şırıngayı da bilgisayar kontrollü şırınga pompasına yerleştirin.
2. Akrilik cihazın tüm hortumlarını ısı ile kapatın.
3. Giriş hortumunu kesin ve sadece birkaç milimetre tutun. Dağıtım iğnesini yıkama tamponu ile doldurun ve kesilen hortuma yerleştirin. Cihaza hava erişimini önlemek için iğneyi cihaza bağlamadan önce solüsyonun damlamasına izin verin.
4. Çıkış hortumunu yanal kanaldan kesin. Şırınga pompasına bağlayın. Ardından, ana kanal çıkış hortumu için aynı prosedürü uygulayın.
   not: 4.3.-4.4 adımlarını gerçekleştirmek çok önemlidir. Bu nedenle, mikropartikül tuzağının ambalajından çıkarılmasını önlemek için. Mümkünse, bu adımlar sırasında bir büyüteç yardımıyla tuzağın durumunu doğrulayın.
5. Mikroskop tablasına bir cam slayt yerleştirin. Mıknatısı çift taraflı bantla sürgüye takın ve talaş kenarlarını cama sabitlemek için her iki tarafa küçük bir parça bant yerleştirin.
6. Şırınga pompası kontrol cihazındaki Akış Hızı ve Birimler sekmeleri aracılığıyla 50 μL/s'lik bir akış hızı ayarlayın. Para çekme modunu seçin ve yıkama tamponunun akışını etkinleştirmek için Başlat düğmesine tıklayın.
7. Cihaza, tuzağı içeren çip alanı mıknatısla temas edecek şekilde yatay bir şekilde mıknatısla sürgüye doğru dikkatlice yaklaşın.
8. Hareketi önlemek için cihazın kenarlarını çift taraflı bantla cama yapıştırın. Mikroskopi için optik yolu engellemekten kaçının (Şekil 1C).

5. İmmün algılama

1. Fazla BSA'yı gidermek için yıkama tamponunun 50 μL/s'de 10 dakika boyunca akmasını sağlayın.
2. Kalan yıkama tamponunu bir mikropipet ile dağıtım iğnesinden çıkarın. 50 μL nanopartikül süspansiyonu ekleyin.
3. Nanopartiküllerin süspansiyonunu 100 μL / s'lik bir akış hızında 7 dakika boyunca akıtın. Ardından, akış hızını 50 μL/s olarak değiştirin ve 15 dakika daha akıtın.
4. Dağıtım iğnesini değiştirin. Yıkama tamponunu 50 μL/s'de 10 dakika boyunca akıtın. Yıkama adımı sırasında florojenik alt tabakayı üreticinin spesifikasyonlarına göre hazırlayın.
5. Kalan yıkama tamponunu bir mikropipet ile dağıtım iğnesinden çıkarın. 100 μL florojenik substrat ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın). Florojenik substratı 50 μL/s'de 6 dakika boyunca akıtın.
6. Akış hızı (1 μL/s, 3 μL/s, 5 μL/s ve 10 μL/s) ve zaman (6 dk) ölçüm parametrelerini ilgili Akış Hızı ve Şırınga pompasını kontrol eden arayüzün Zamanlayıcı Ayar sekmelerinde ayarlayın. Gerçekleştirilecek ölçümlerin her biri için Para Çekme modunu seçtiğinizden emin olun.
7. Yıkama adımı için 50 μL/s'ye ek bir Akış Hızı sekmesi ayarlayın ve Zamanlayıcıyı 3 dakikaya ayarlayın.
8. Alt tabaka 50 μL/s'de durmadan 15 saniye önce mikroskobun floresansını açın. Alt tabaka durmadan 10 saniye önce mikroskop kamerasının yazılımıyla görüntü yakalamayı başlatın ve 1,000 milisaniyelik bir pozlama süresi elde edin. 1 kare/sn'de (FPS) 6 dakika boyunca görüntüleme gerçekleştirin.
9. 50 μL/s'deki alt tabaka yıkama akış hızı durduktan hemen sonra istenen akış hızı parametresinin Başlat düğmesine tıklayın. Seçilen ölçüm akışı durduktan hemen sonra yıkama akışının (50 μL/h) Başlat düğmesine tıklayın.
10. Alt tabakanın foto-ağartmasını önlemek için görüntü yakalamayı durdurun ve mikroskobun floresansını kapatın.
11. Kullanılan her ölçüm akış hızı için 5.8.-5.10. adımlarını tekrarlayın.

Sonuçlar

Şekil 1: Son cihaz yapılandırması. (A) Hortumları ilgili giriş ve çıkışlara bağlı akrilik cihaz. Ölçek, cihazın boyutlarını santimetre cinsinden gösterir. (B) Mikropartikül tuzağının oluşumu için protokol. Mikropartiküller, cihaz dikey konuma yerleştirildiğinde yerçekimi ile kanaldan akar. Mikropartiküller 5 μm kısıtlamasında konsantre edilir. Fazla mikropartiküller, ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Karbonil-demir mikropartikülleri	Sigma-Aldrich	44890	7 μm
kloroform	Fermont	6201	Sağlık Tehlikesi: Orta Yanıcılık: Yok Reaktivite: Yok Temas Tehlikesi: Orta
CMOS kamera Momenti	Teledyne Fotometri		Sensör Teknolojisi: CMOS Kuantum Verimliliği: %73 Piksel Boyutu: 4.5 μm x 4.5 μm Desteklenen Arayüzler: USB 3.2 Gen 2
Dr Gravür Yazılımı	Roland DGA Şirketi		Yüzeyde gravür yolunu tasarlamak ve oluşturmak için gravür yazılımı
Davlumbaz	bilinmeyen	bilinmeyen
Esnek Plastik Boru	Tygon Gölü	AAD04103	Kimlik = 0.020, OD = 0.060
Floresan mikrosop	Zeiss	Axio Vert.A1
Yüksek Hassasiyetli Dağıtım İğnesi	Loctite	98612
MagJET Ayırma Rafı	termo bilimsel		12 x 1,5 mL
Polimetilmetakrilat - Levha - PMMA, Akrilik	İyi adam	ME303018/1	Kalınlık: 1,3 mm, Şeffaflık: Şeffaf/Şeffaf
PVCamTest yazılımı	Teledyne Fotometri	Sürüm 3.10.107	Görüntü elde etme yazılımı
Stereo mikroskop	Nikon	SMZ 7457
SuperMag Karboksil Boncuklar	Okyanus Nano Teknolojisi	KSC0100	100 deniz mili
Şırınga pompası	kd Bilimsel	KDS200	İki şırıngaya kadar tutabilir
Ütrasonik banyo	Branson	2800
VPanel yazılımı	Windows İşletim Sistemi	Sürüm 1.0.3.0	Mikro freze makinesini kontrol etmek için yazılım