Mikroakışkan Bir Cihaz Kullanan Manyetik Nanopartikül Bazlı Bir İmmünoassay

1. Cihaz hazırlığı

1. Kanalları bir şırınga kullanarak damıtılmış suyla doldurun. Sızıntı veya akışa karşı direnç olmadığından emin olun. Kanalların içinde kalan akrilik, yapışkan veya istenmeyen malzemeleri çıkarmak için cihazı 10 dakika boyunca ultrasonik banyoya daldırın.
2. Cihaz kanallarının içindeki suyu boşaltın. % 5 (a / h) sığır serum albümini (BSA) ile hazırlanan, 1x Tris tamponlu salin (TBS) içinde seyreltilmiş ve daha önce 0.2 μm polietersülfon (PES) şırınga filtresinden süzülmüş bir bloke edici çözelti eklemek için bir şırınga kullanın.
3. %5 BSA.
   içinde 7,5 μm çapında demir mikropartiküllerden oluşan bir süspansiyon hazırlayın not: Mikropartiküller daha önce protein emilimine direnç sağlayan bir silika-polietilen glikol (PEG) tabakası ile işlevselleştirilmişti.
4. Çipi ve mikropartikül süspansiyonunu oda sıcaklığında en az 1 saat boyunca bloke edici çözelti ile inkübe edin. Mümkünse, gece boyunca 4 °C'de engellemeye izin verin.

2. Mikropartikül tuzağı oluşumu

1. Mikropartikülleri yan kanal çıkış hortumundan bir şırınga iğnesi ile çipin içine yerleştirin. Çipi dikey olarak yerleştirin ve mikropartiküllerin yerçekimi etkisi altında yan kanaldan akmasına izin verin. Çipi 90°'lik iki adımda 180° döndürün ve mikropartiküllerin 5 μm kısıtlamasında hedeflemesine ve sıkışmasına izin verin.
2. Yerçekimi ile yan kanala doğru 45° döndürerek fazla mikropartikülleri çıkarın.
3. Mikropartikül tuzağının çözülmesini önlemek için cihazı dik tutun. Mikropartikül tuzağı oluşum sürecinin bir özeti için Şekil 1B'ye bakın.

3. İmmünoassay

1. Nanopartikül hazırlama
   1. Daha önce lizozim (antijen modeli) ile konjuge edilmiş 100 nm nanopartiküllerin süspansiyonunun 2 μL'sini alın. 100 μL bloke edici çözelti içeren 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
   2. 150 μL yıkama tamponu ekleyin (1x TBS, %0,05 Tween 20).
   3. 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünü manyetik bir ayırıcıya yerleştirin. Nanopartiküllerin ayrılmasına izin vermek için 15 dakika saklayın (Şekil 2).
      not: Manyetik ayırıcı için minimum hacim 200 μL'dir. Daha küçük bir hacim kullanmaktan kaçının.
   4. Sıvıyı bir mikropipet ile tüpten çıkarın. Nanopartikül peletinin oluştuğu tüpün duvarı ile temastan kaçının.
   5. 250 μL taze yıkama tamponu ekleyin. Tüpü 15 dakika çalkalayın.
   6. 3.1.3.-3.1.5 adımlarını tekrarlayın. 2 kat daha fazla, sadece 5 dakika sallayın.
   7. İstenilen konsantrasyonda primer anti-lizozim antikoru ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). Antikor seyrelticide 100 μL'lik bir son hacme ayarlayın (1x TBS, %1 BSA, %0.05 Tween 20).
   8. 37 °C'de 15 dakika inkübe edin. Oda sıcaklığında 15 dakika daha çalkalamaya devam edin.
   9. 3.1.2.-3.1.6 yıkama adımlarını tekrarlayın.
   10. 100 μL antikor seyreltici ekleyin. Yaban turpu peroksidaz bağlı ikincil antikoru (HRP-AbII) (Malzeme Tablosuna bakınız) 1:500 seyreltmede ekleyin.
   11. 3.1.2.-3.1.6 yıkama adımlarını tekrarlayın.
   12. Nanopartikülleri 50 μL antikor seyrelticisinin son hacminde tutun.

4. Deneysel montaj

1. İki adet 100 μL'lik cam şırıngayı suyla doldurun, her şırıngaya 6,5 cm uzunluğunda bir hortum bağlayın, hortumun ucuna metal bir pim yerleştirin ve her iki şırıngayı da bilgisayar kontrollü şırınga pompasına yerleştirin.
2. Akrilik cihazın tüm hortumlarını ısı ile kapatın.
3. Giriş hortumunu kesin ve sadece birkaç milimetre tutun. Dağıtım iğnesini yıkama tamponu ile doldurun ve kesilen hortuma yerleştirin. Cihaza hava erişimini önlemek için iğneyi cihaza bağlamadan önce solüsyonun damlamasına izin verin.
4. Çıkış hortumunu yanal kanaldan kesin. Şırınga pompasına bağlayın. Ardından, ana kanal çıkış hortumu için aynı prosedürü uygulayın.
   not: 4.3.-4.4 adımlarını gerçekleştirmek çok önemlidir. Bu nedenle, mikropartikül tuzağının ambalajından çıkarılmasını önlemek için. Mümkünse, bu adımlar sırasında bir büyüteç yardımıyla tuzağın durumunu doğrulayın.
5. Mikroskop tablasına bir cam slayt yerleştirin. Mıknatısı çift taraflı bantla sürgüye takın ve talaş kenarlarını cama sabitlemek için her iki tarafa küçük bir parça bant yerleştirin.
6. Şırınga pompası kontrol cihazındaki Akış Hızı ve Birimler sekmeleri aracılığıyla 50 μL/s'lik bir akış hızı ayarlayın. Para çekme modunu seçin ve yıkama tamponunun akışını etkinleştirmek için Başlat düğmesine tıklayın.
7. Cihaza, tuzağı içeren çip alanı mıknatısla temas edecek şekilde yatay bir şekilde mıknatısla sürgüye doğru dikkatlice yaklaşın.
8. Hareketi önlemek için cihazın kenarlarını çift taraflı bantla cama yapıştırın. Mikroskopi için optik yolu engellemekten kaçının (Şekil 1C).

5. İmmün algılama

1. Fazla BSA'yı gidermek için yıkama tamponunun 50 μL/s'de 10 dakika boyunca akmasını sağlayın.
2. Kalan yıkama tamponunu bir mikropipet ile dağıtım iğnesinden çıkarın. 50 μL nanopartikül süspansiyonu ekleyin.
3. Nanopartiküllerin süspansiyonunu 100 μL / s'lik bir akış hızında 7 dakika boyunca akıtın. Ardından, akış hızını 50 μL/s olarak değiştirin ve 15 dakika daha akıtın.
4. Dağıtım iğnesini değiştirin. Yıkama tamponunu 50 μL/s'de 10 dakika boyunca akıtın. Yıkama adımı sırasında florojenik alt tabakayı üreticinin spesifikasyonlarına göre hazırlayın.
5. Kalan yıkama tamponunu bir mikropipet ile dağıtım iğnesinden çıkarın. 100 μL florojenik substrat ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın). Florojenik substratı 50 μL/s'de 6 dakika boyunca akıtın.
6. Akış hızı (1 μL/s, 3 μL/s, 5 μL/s ve 10 μL/s) ve zaman (6 dk) ölçüm parametrelerini ilgili Akış Hızı ve Şırınga pompasını kontrol eden arayüzün Zamanlayıcı Ayar sekmelerinde ayarlayın. Gerçekleştirilecek ölçümlerin her biri için Para Çekme modunu seçtiğinizden emin olun.
7. Yıkama adımı için 50 μL/s'ye ek bir Akış Hızı sekmesi ayarlayın ve Zamanlayıcıyı 3 dakikaya ayarlayın.
8. Alt tabaka 50 μL/s'de durmadan 15 saniye önce mikroskobun floresansını açın. Alt tabaka durmadan 10 saniye önce mikroskop kamerasının yazılımıyla görüntü yakalamayı başlatın ve 1,000 milisaniyelik bir pozlama süresi elde edin. 1 kare/sn'de (FPS) 6 dakika boyunca görüntüleme gerçekleştirin.
9. 50 μL/s'deki alt tabaka yıkama akış hızı durduktan hemen sonra istenen akış hızı parametresinin Başlat düğmesine tıklayın. Seçilen ölçüm akışı durduktan hemen sonra yıkama akışının (50 μL/h) Başlat düğmesine tıklayın.
10. Alt tabakanın foto-ağartmasını önlemek için görüntü yakalamayı durdurun ve mikroskobun floresansını kapatın.
11. Kullanılan her ölçüm akış hızı için 5.8.-5.10. adımlarını tekrarlayın.

Şekil 1: Son cihaz yapılandırması. (A) Hortumları ilgili giriş ve çıkışlara bağlı akrilik cihaz. Ölçek, cihazın boyutlarını santimetre cinsinden gösterir. (B) Mikropartikül tuzağının oluşumu için protokol. Mikropartiküller, cihaz dikey konuma yerleştirildiğinde yerçekimi ile kanaldan akar. Mikropartiküller 5 μm kısıtlamasında konsantre edilir. Fazla mikropartiküller, çipin yan kanaldan döndürülmesiyle kolayca çıkarılır. İmmünoassayden önce tuzağı korumak için çip dikey tutulur. (C) Ters çevrilmiş floresan mikroskobu sahnesinde, mıknatısı içeren bir cam slayt üzerine monte edilmiş mikroakışkan cihaz. Reaktiflerin eklendiği dağıtım iğnesinin yanı sıra bir şırınga pompasına bağlanan çıkış hortumları gözlenir.

Şekil 2: Nanopartikül ayrımı. Ticari bir manyetik ayırıcı kullanılarak, 100 nm nanopartiküller, immünolojik test sırasında yıkama adımlarını gerçekleştirmek için kolayca konsantre edilebilir. 15 dakika sonra oluşan saçma kırmızı daire içinde gözlenir.