$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
>NOT: Bu adımlarda yumurtalık kanseri hücre hattı olan OVCAR3 kullanılmıştır, ancak bu protokol, yumurtalık dışı kaynaklardan türetilenler de dahil olmak üzere diğer birçok hücre hattına geniş ölçüde uygulanabilir. Protokolün bir şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.
1. Hücrelerin kaplanması
- Poli-L-lizin kaplı lameller yapın.
- Poli-L-lizin çözeltisi içeren 50 mL'lik konik bir tüpe otoklavlanmış 12 mm çapında lameller ekleyin ve 15 dakika boyunca bir külbütör üzerine yerleştirin.
- Çözeltiyi bir doku kültürü başlığında aspire edin. Lamelleri steril su ilave ederek yıkayın ve lamelleri içeren tüpü 5 dakika boyunca külbütörün üzerine yerleştirin. Bu yıkama adımını üç kez tekrarlayın.
- Kaplanmış lamelleri steril bir tabağa yayın ve kalan suyu aspire edin. Lamelleri doku kültürü başlığında 1 saat veya su damlacıkları kalmayana kadar kurumaya bırakın. Kuruduktan sonra kabı parafilm ile kapatın ve 4 °C'ye koyun.
- 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna bir poli-L-lizin kaplı lamel yerleştirin. Poli-lizin lamellerinin kullanılması, ön ekstraksiyon adımı sırasında hücrelerin lamellerden ayrılmasını önlemek için kritik öneme sahiptir.
- OVCAR3 hücrelerini% 70 -% 80 birleşmeye ulaştıklarında tripnize edin.
- %70-80 birleşik olan 10 cm'lik bir kültür kabını tripsinize etmek için, ortamı plakadan aspire edin ve 5-7 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
- PBS'yi aspire edin, 1 mL% 0.25 tripsin ekleyin ve tabağı 8-10 dakika boyunca veya hücreler plakanın altından kalkana kadar 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
- Hücreleri 5-10 mL ortam ile toplayın ve konik bir tüpe ekleyin.
- Standart prosedürleri kullanarak hücreleri bir hemositometre ile manuel olarak sayın.
- 25.000 hücre / mL'lik bir seyreltme yapın ve 24 oyuklu plakaların oyuklarına yerleştirilen poli-L-lizin lamelleri üzerine 1 mL hücre ekleyin. Başka herhangi bir hücre hattı için, üç popülasyon ikiye katlandıktan sonra hücrelerin yaklaşık% 70 -% 80 birleştiği bir sayı belirleyin.
- Hücreleri standart koşullar altında kültür ortamında büyütün.
2. IdU ile titreşen hücreler
- Hücrelerin lamellere düzgün bir şekilde yayılması için, bir popülasyonun iki katına çıkması yeterlidir. Bir popülasyon ikiye katlandıktan sonra, sonraki iki popülasyon ikiye katlanması için hücreleri 10 μM 5-iyodo-2'-deoksiüridin (IdU) ile darbeleyin (IdU'nun nasıl yeniden oluşturulacağına ilişkin Malzeme Tablosuna bakınız).
not: Bromodeoksiüridin (BrdU), 5-kloro-2 "-deoksiüridin (CIdU) ve IdU dahil olmak üzere farklı timidin analoglarını denedik. Üç analog arasında IdU en iyi sinyal-gürültü oranını verir. Üç farklı analogla darbeli hücrelerin karşılaştırmalı görüntüleri Şekil 2'de gösterilmektedir. İki negatif kontrolün kullanılmasını öneririz: (i) IdU darbeli numune yok ve (ii) primer antikor kontrolü yok. Belirli bir tedaviye bağlı olarak ssDNA oluşumunun değerlendirilmesi gerekiyorsa, ilacın IdU ikiye katlamasının ilk turundan sonra eklenmesini öneririz.
- İki popülasyon ikiye katlaması için IdU ile nabız attıktan sonra, görüntüleme için hücreleri hasat edin.
- Ortamı buz gibi soğuk %0,5 PBSTx (PBS + %0,5 Triton X-100) ile 5 dakika buz üzerinde değiştirin. Bu ön ekstraksiyon adımı, sitoplazmik ve kromatine bağlı olmayan proteinlerin serbest bırakılmasına yardımcı olur ve kromatine bağlı proteinleri olduğu gibi bırakır. Bazı hücre hatları, ön ekstraksiyon sırasında kolayca soyulabilir. Böyle bir senaryoda% 0.5 CSK tamponu (10 mM PIPES (pH 6.8), 100 mM sodyum klorür (NaCl), 300 mM sükroz, 3 mM magnezyum klorür (MgCl2), 1 mM etilen glikol tetraasetik asit (EGTA) ve% 0.5 Triton X-100).
3. Fiksasyon
- PBSTx'i aspire edin ve oda sıcaklığında% 3 paraformaldehit (PFA) (Malzeme Tablosu) ile 15 dakika inkübe edin, ardından 1x PBS ile üç ila dört yıkama yapın. Sabit hücreler daha sonraki adımlara kadar 4 ° C'de tutulabilir.
DİKKAT: PFA oldukça toksik ve kanserojendir. Cilt, göz ve mukoza zarlarıyla temasından kaçının. PFA ile tüm adımları çeker ocakta gerçekleştirin ve malzemeleri uygun şekilde atın.
4. Geçirgenlik ve engelleme
- Fiksasyondan sonra, 5 dakika boyunca buz üzerinde% 0.5 PBSTx kullanarak hücrelere nüfuz edin. Tüm lamel kaplamak için yeterli hacim kullanın (tipik olarak 500 μL ile 1 mL arasında).
- Hücreleri oda sıcaklığında% 0.2 PBST (1X PBS +% 0.2 Tween-20) ile üç ila dört kez yıkayın. Her kuyucuğu yıkamak için bir mL PBST yeterlidir. Yıkamaları herhangi bir inkübasyon olmadan arka arkaya yapın.
- PBST'yi aspire edin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 5 sığır serum albümini, 1x PBS'de (bloke edici tampon) yapılan BSA (Malzeme Tablosu) kullanarak örnekleri bloke edin.
>5. IdU antikoru ile immün boyama
- İmmün boyama için nemlendirilmiş bir oda hazırlayın (düz tabanlı bir Tupperware üzerinde ıslak kağıt havlu). 24 oyuklu plakanın kapağını parafilm ile örtün, nemlendirilmiş hazneye yerleştirin ve lamelleri plaka kapağının üzerine yerleştirin.
- Anti-BrdU birincil fare antikorunu (Malzeme Tablosu) adım 4.2'den itibaren bloke edici tamponda 1:200 oranında seyrelterek hazırlayın. Anti-BrdU antikorunun daha önce IdU'yu tespit ettiği gösterilmiştir.
- Lamellerin üstüne 60 μL IdU antikor seyreltmesi ekleyin. Lamelleri 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
- Alternatif olarak, lameller parafilm üzerine pipetlenmiş bir damla (20-25 μL) 1:200 antikor seyreltme üzerine çevrilirse daha az antikor çözeltisi kullanın. Bu aynı zamanda inkübasyon sırasında çözeltinin kuruma olasılığını da azaltır.
- 1 saatlik inkübasyondan sonra, birincil antikoru aspire edin. Lamelleri 24 oyuklu bir plakaya geri koyun ve% 0.2 PBST ile dört kez yıkayın.
- İkincil antikor için, adım 5.1'de açıklanan aynı nemlendirilmiş odayı kullanın. Anti-fare konjuge ikincil antikoru (Malzeme Tablosu) bloke edici tamponda (1:200) seyreltin. Lamellere 60 μL ikincil antikor ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
- İkincil antikoru aspire edin. Lamelleri 24 oyuklu plakaya geri koyun ve% 0,2 PBST ile dört kez yıkayın.
- Mikroskop slaytlarını etiketleyin ve lamelleri 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) montaj ortamı (Malzeme Tablosu) ile lamellerin üzerine monte edin. Slaytları karanlıkta oda sıcaklığında 24 saat saklayın. Montaj ortamının kürlenmesi veya sertleştirilmesi gerekiyorsa 24 saatlik inkübasyon önerilir.
not: Slaytlar daha sonra bir floresan mikroskobunda görüntülenmeden önce 4 °C'de saklanabilir. Temsili bir resim Şekil 3'te gösterilmiştir.
