Çapraz Reaktivitesiz Çoklanmış Sandviç İmmünoassay için Bir Snap Chip Teknolojisi

Özet

Kaynak: Li, H. ve diğerleri, Çapraz reaktivitesiz ve Gözcüsüz Çoklanmış Sandviç İmmünoassay için Snap Chip.J. Vis. Uzm. (2017)

Video, çapraz reaktivite içermeyen çoğullanmış sandviç immünolojik testler için çıtçıtlı çip teknolojisinin uygulanmasını göstermektedir. Her biri farklı reaktifler içeren iki mikrodizi slaytını koparmanın basit eylemi, çapraz kontaminasyon olmadan reaktif transferini sağlar ve sandviç immünolojik test kullanılarak birden fazla proteinin tespit edilmesine yardımcı olur.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Çıtçıtlı talaşların imalatı ve depolanması

1. Tek transfer yöntemi (Şekil 1a)
   1. Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 400 μg/mL antikor ve %20 gliserol içeren cAb çözeltileri, 800 μm merkezden merkeze aralık ile %60 bağıl nemde (her nokta için 1,2 nL) bir mürekkep püskürtmeli mikrodizi gözcü ile bir nitroselüloz (veya işlevselleştirilmiş bir cam) tahlil kayar. Sürgünün gözcü güvertesine bir köşeye göre sabitlendiğinden emin olun (burada sol alt köşe kullanılmıştır).
   2. Benekli tahlil slaytını oda sıcaklığında 1 saat boyunca %60 bağıl nem ile inkübe edin.
   3. 16 kuyucuğa bölmek için tahlil sürgüsü üzerine 16 bölmeli bir kayar modül contasını sıkıştırın. Her bir oyuğa %0,1 Tween-20 (PBST) içeren 80 μL PBS ekleyerek ve her seferinde 5 dakika olmak üzere bir çalkalayıcı üzerinde 450 rpm'de çalkalayarak sürgüyü üç kez durulayın.
   4. Her kuyucuğa 80 μL engelleme solüsyonu ekleyin ve 450 rpm'de 1 saat çalkalayın.
   5. Contayı çıkarın ve tahlil sürgüsünü bir nitrojen akışı ile kurulayın.
   6. Gözcü güvertesinde bir transfer sürgüsünü sabitleyin ve sürgünün sol alt köşesini gözcü güvertesinin sol alt köşesine doğru itin. Inkjet, yakalama antikorları (cAb'ler) ile aynı düzene sahip bir dizi hizalama işaretini (polistiren mikro boncuklardan oluşan bir çözelti) tespit eder.
   7. Hizalama işaretlerinin kurumasını bekleyin. Aktarma sürgüsünü çevirin ve sol alt köşeye sabitleyerek gözcü güvertesine geri koyun.
   8. 20 μg/mL antikor, %20 gliserol ve %1 sığır serum albümini (BSA) içeren tespit antikoru (dAb) lekelenme solüsyonlarını hazırlayın.
   9. Gözcü kamerasını kullanarak bir hizalama işaretinin fotoğrafını çekin. Bu resmi bir referans olarak tespit programına uygulayın ve sol üst işareti tanımlamak için mürekkep püskürtmeli gözcünün görüntü tanıma sistemini edinin. Koordinatını dAb dizisinin ilk noktası olarak kullanın. Merkezden merkeze 800 μm aralık ile damlacık başına 8 nL nokta.
2. Çift transfer yöntemi (Şekil 1b)
   1. Mürekkep püskürtmeli gözcü güvertesine sol alt köşeye doğru bir transfer slaytı 1 yerleştirin. PBS'de 400 μg/mL antikor, %20 gliserol ve %1 BSA içeren cAbs solüsyonlarını, %60 bağıl nemde (her nokta için 0,4 nL ve ~ 200 μm çapında) bir mürekkep püskürtmeli mikrodizi gözcü ile slayt üzerine yerleştirin. Merkezden merkeze aralık 400 μm'dir.
   2. CAb damlacıklarını tahlil slaydına aktarmak için bir çıtçıt aparatı (Şekil 2) kullanarak transfer slaydını nitroselüloz kaplı (veya işlevselleştirilmiş bir cam) tahlil lamı ile oturtun.
      1. Tüm pistonları açık konumda çekmek ve kilitlemek için çıtçıt aparatının yan tarafındaki altı düğmeyi de 90 derece çevirin. Aktarım sürgüsünü, kırpılmış köşesi sabit pogo pimine bakacak şekilde yuvasındaki sürgü tutucusuna yerleştirin. Altın pogo pimi ile pistonları serbest bırakmak için ilk üç düğme setini çevirin ve kızakların hizalama pimlerine doğru itildiğinden emin olun.
      2. Nitroselüloz kaplı bir sürgüyü, 4 pogo piminin üzerine oturan baş aşağı geçme aparatına yerleştirin. Gümüş pimli pistonları serbest bırakmak için ikinci üç düğme setini çevirin ve kızakların hizalama pimlerine doğru itildiğinden emin olun.
      3. Hassas bir konumlandırma için hizalama direklerini ve deliklerini kullanarak üst kabuğu kayar tutucuya yerleştirerek çıtçıt aparatını kapatın.
      4. Kapalı çıtçıt aparatını kafesine yerleştirin ve uygun basıncı uygularken mikrodizileri yüz yüze getirmek için kapatma tırnağını tamamen aşağı doğru itin. 1 dakika kapalı tutun.
   3. Slaytları ayırın. Tahlil slaydını oda sıcaklığında 1 saat boyunca %60 bağıl nem ile inkübe edin. Test slaytını adım 1.1.3 - 1.1.5'te açıklandığı gibi yıkayın, bloke edin ve kurutun.
   4. Mürekkep püskürtmeli gözcü güvertesine başka bir transfer sürgüsü yerleştirin ve sol alt köşeye doğru itin. PBS'de 50 veya 100 μg/mL antikor (bakınız Tablo 1), %20 gliserol ve %1 BSA içeren spot dAb solüsyonları. Her noktanın 0,8 nL olduğundan ve noktalar arasındaki merkezden merkeze aralığın 400 μm olduğundan emin olun.
   5. Tahlili ve transfer slaytını saklayın. Hem tahlil hem de transfer slaytlarını kurutucu içeren hava geçirmez bir torbaya kapatın ve -20 ° C'lik bir dondurucuya koyun.

2. Çıtçıtlı çiplerle çoğullanmış immünolojik testler

1. Tahlil slaytını dondurucudan alın. Slayt oda sıcaklığına gelene kadar torbayı 30 dakika kapalı bırakın.
2. % 0.05 Tween-20 içeren PBS'de proteinleri spiking yaparak 7 noktalı seri seyreltilmiş numune çözeltileri hazırlayın.
   not: Burada 5 kat seyreltme faktörü kullanılır. Her protein için başlangıç konsantrasyonları Tablo 1'de listelenmiştir.
3. Örnek çözeltileri uygun şekilde hazırlayın. Örneğin, insan serumunu PBST tamponunda 4 kez seyreltin.
4. Tahlil sürgüsüne 16 bölmeli bir conta sıkıştırın.
5. 8 kuyucuğun bir sütununu 7 protein seyreltme çözeltisi ve pipetleme yoluyla protein içermeyen bir PBST tampon çözeltisi ile doldurun. Diğer 8 kuyucuktaki numune çözeltilerini aynı slaytta pipetleyin.
   NOT: Her kuyucuğa 80 μL'lik çözeltiler sığdırılabilir. Gerektiğinde ek numuneleri ölçmek için daha fazla slayt kullanılabilir.
6. Numuneleri 450 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca 4 °C'de inkübe edin. Sürgüyü, çalkalayıcı üzerinde PBST ile her seferinde 450 dakika, 5 dakika olmak üzere üç kez yıkayın. Contayı çıkarın ve sürgüyü bir nitrojen gazı akışı altında kurutun.
7. dAbs ile transfer sürgüsünü dondurucudan alın. Torbayı oda sıcaklığında 30 dakika kapalı tutun. Ardından, slaytı rehidrasyon için 20 dakika boyunca %60 nem stabilizasyon boncukları içeren kapalı bir odada (örn. boş uç kutusu) inkübe edin.
8. dAb damlacıklarını aktarmak için bir çıtçıt aparatı (Şekil 2) kullanarak transfer slaytını tahlil slaydı ile tutturun. Çıtçıt aparatının çalıştırılması için bölüm 1.2.2'ye bakınız.
9. Slaytları ayırın. Tahlil slaytını% 60 nem stabilizasyon boncukları içeren kapalı bir odada 1 saat inkübe edin. Tahlil sürgüsünü 16 bölmeli bir conta ile sıkıştırın ve her seferinde 5 dakika olmak üzere 450 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde PBST kullanarak sürgüyü 4 kez durulayın.
10. PBS'de 2,5 μg/mL streptavidin florofor içeren 80 μL çözeltiyi her bir oyuğa pipetleyin. 450 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde 20 dakika inkübe edin.
11. Sürgüyü 3 kez PBST ile ve bir kez damıtılmış su ile çalkalayıcı üzerinde 450 rpm'de durulayın. Contayı çıkarın ve sürgüyü nitrojen gazı kullanarak kurutun.

3. Slayt tarama ve veri analizi

1. 635 nm lazer kullanarak tahlil slaydını bir floresan mikrodizi tarayıcı ile tarayın.
2. Bir analiz yazılımı (örn. array-pro analizörü) kullanarak her noktanın net yoğunluğunu çıkarın.
3. Bir istatistik yazılımı kullanarak her proteinin tespit limitini (LOD) hesaplayın ve numunelerdeki protein konsantrasyonlarını belirleyin.
   not: LOD, üç bağımsız tahlilin standart sapmasının üç katı kadar artırılan standart eğrinin Y-kesişimi olarak tanımlanır.

Tablo 1. 50 pleklik testten tampondaki protein konsantrasyonları ve LOD'ler. CA 15-3 için LOD, U/ml (*) cinsindendir.

) ) Serisi ) Serisi Serisi Serisi ) Serisi (İngilizce) Serisi Serisi )

Protein adı	Başlangıç konsantrasyonu (ng/ml)	LOD (sayfa / ml)	Protein adı	Başlangıç konsantrasyonu (ng/ml)	LOD (sayfa / ml)
ANG2	500	1.3 × 104	IL-6b	1	2.1 × 102
BDNF (BDNF)	500	1.0 × 102	IL-5 (İngilizce	50	77
CA 15-3*	1	4.9 × 103	IL-4	1000	1.5 × 104
Cea	1000	5.4 × 103	IL-2 (İngilizce	50	76
CXCL10/IP-10	50	1.7 × 102	LEP (Türkçe)	200	4.0 × 102
Crp	200	44	Mig	500	11 × 102
Eng	1000	6.2 × 102	CCL3 / MIP-1α	50	3.3
EGF (Türkçe)	50	1.8 × 102	CCL4 / MIP-1β	50	12
EGFR (İngilizce	200	1.9 × 102	MMP-3	500	1.0 × 102
FAS-L	500	4.5 × 102	M-CSF (Mali İşler Örgütü)	500	8.2 × 103
Kadın Sünneti	500	1.0 × 103	MMP-9	200	3.1 × 102
G-CSF (Coğrafi Bilgi Bankası)	500	39	CCL2/MCP-1	50	55
GM-CSF (Genel Müdür)	50	3.8	NCAM-1 (İngilizce	500	1.7 × 103
GRO-α	50	3.0 × 102	β-NGF	200	1.4 × 103
HER2	500	3.5 × 103	NT-3	200	5.8 × 102
PDGF-BB	200	73	OPN (Operasyon Operasyonu	500	1.9 × 103
IL-1β	500	7,9 × 102	RBP4	200	1.2 ×102
IL-1ra	200	1.1 × 103	Sparc	1000	4.6 ×104
IL-15	50	8.2 × 102	TNF-α	50	4.4
IL-12	1	30	TNF-RI	50	1.3 × 102
IL-11	500	1.2 × 103	TNF-RII	50	12
IL-10	500	6.1 ×102	FAS/TNFRSF6	200	2.8 ×102
IL-8	50	6,6	uPA (İngilizce	200	24
IL-7	2,5	26	uPAR(CD87)	200	76
IL-6bir	1000	84	VEGF (Sebze Mutfağı)	200	6.7 × 102

Sonuçlar

Şekil 1. (a) tek ve (b) çift transfer yöntemlerini karşılaştıran tahlil prosedürünün şeması.

Şekil 2. Tek ve çift transfer arasındaki farkları gösteren şematik.(a) transfer reaktiflerinin yansıtılması, slayt ile mürekkep püskürtmeli XY aşaması arasındaki...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Fosfat tamponlu tuzlu su tableti	Balıkçı Bilimsel	5246501EA
Streptavidin konjuge Cy5	Rockland	S000-06
Ara-20	Sigma-Aldrich	P1379 Serisi
Sığır serum albümini	Jackson İmmünoAraştırma Laboratuvarları, Inc	001-000-162
Gliserol	Sigma-Aldrich	G5516
Engelleme çözümü: BSA içermeyen StabilGuard Choice Mikrodizi Sabitleyici	SurModics, Inc	SG02
Nitroselüloz kaplı slaytlar	Grace Biyo-Laboratuvarlar A.Ş	305116
Aminosilan kaplı slaytlar	Schott Kuzey Amerika	1064875
Snap Cihazı	Parallex Biyotahliller A.Ş.	PBA-SD01
Mürekkep püskürtmeli mikrodizi gözcü	GeSiM	Nanoplotter 2.0
Sürgülü modül contası	Grace Biyo-Laboratuvarlar A.Ş	204862
Nem Stabilizasyon Boncukları	Parallex Biyotahliller A.Ş.	PBA-HU60
Array-Pro Analyzer yazılımı	Medya Sibernetik	Sürüm 4.5
Floresan mikrodizi tarayıcı	Yaşlı	SureScan Mikroarray Tarayıcı
Biyoistatistik yazılımı	GraphPad Yazılımı	GraphPad Prizma 6
Endoglin yakalama antikoru	Ar-Ge Sistemleri	MAB10972
Endoglin proteini	Ar-Ge Sistemleri	1097-EN
Endoglin tespit antikoru	Ar-Ge Sistemleri	BAF1097
IL-6a (bakınız Tablo 1)	Ar-Ge Sistemleri
IL-6b (bakınız Tablo 1)	Canlandırıcı

Serisi Gazetesi Gazetesi Serisi Serisi . Serisi . Serisi