Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. İlk Antikor ile Boyama
- Aşağıdaki adımların her birine 5 dakika ayrılarak formalinle sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) slaytları mumdan arındırın ve yeniden sulandırın: ksilen veya eşdeğer reaktifler 3x, %100 etanol 2x, %95 etanol 1x, %70 etanol 1x, %50 etanol 1x ve damıtılmış su 2x.
not: Slaytlar, bu rehidrasyon adımından başlayarak son adımdaki montaja kadar nemli kalmalıdır.
- İsteğe bağlı antijen alımı için, slaytları 8 dakika boyunca 275 mL kaynar sodyum sitrat çözeltisine (10 mM, pH = 6.0) yerleştirin. Çözeltiyi kaynatmak için, slaytları kapaklı 14 x 9,5 x 9 cm3 (G x U x Y) pipet ucu kutusunun altına düz bir şekilde yerleştirin ve çözeltiyi 70 W'lık bir mikrodalga fırında %700 güçle 8 dakika mikrodalgada pişirin. Ardından pipet ucu kutusunu mikrodalga fırından çıkarın, kapağı açın ve solüsyonu oda sıcaklığında (RT) en az 20 dakika soğumaya bırakın.
- Slaytları PBST (% 0.1 polisorbat 20/80 ile fosfat tamponlu salin) içeren bir Coplin kavanozuna aktarın. PBST ile 5 dakika 3 kez yıkayın. Hemen bir sonraki adıma geçmiyorsanız, bu adımda slaytları PBST ile RT'de bir Coplin kavanozunda birkaç saat veya hemen bir sonraki adıma geçmeyecekse 4-2 gün boyunca 1-2 ° C'de saklayın.
- Bloke edici çözeltiyi hazırlamak için, bloke edici reaktif olarak ikincil antikorun konakçı türünün normal serumunu kullanın. Diğer ticari bloke edici reaktifler de kullanılabilir. Bu çalışmada sunulan çalışma için kullanılan normal serum kullanılıyorsa, 4.9 mL PBST'ye 100 μL normal eşek serumu ekleyin. Blokaj çözeltisi 4 °C'de 3 güne kadar saklanabilir.
- Engelleme için, PBST'yi slaytlardan silkeleyin ve bunları hızlı bir şekilde yeterli engelleme solüsyonu ile örtün. Slaytları RT'de nemlendirilmiş bir odada 30 dakika inkübe edin.
- Primer antikoru istenen konsantrasyona seyreltmek için bloke edici solüsyonu kullanarak primer antikor solüsyonunu (iki slayt için 500 μL) hazırlayın. Çözelti kullanılana kadar buz üzerinde saklanmalıdır.
- 3β-hidroksisteroid dehidrojenaz (3βHSD) için, 498 μL bloke edici çözeltiye 2 μL 3βHSD antikoru ekleyin.
- Tirozin hidroksilaz (TH) için, 499 μL bloke edici çözeltiye 0.5 μL TH antikoru ekleyin.
- β-katenin için, 499 μL bloke edici çözeltiye 1 μL β-katenin antikoru ekleyin.
- 20α-hidroksisteroid dehidrojenaz (20αHSD) için, 499 μL bloke edici çözeltiye 1 μL 20αHSD antikoru ekleyin.
- Sitokrom P450 2F2 (CYP2F2) için, 498 μL bloke edici çözeltiye 2 μL CYP2F2 antikoru ekleyin.
- Slaytlardan bloke edici solüsyonu silkeleyerek ve bunları hızlı bir şekilde yeterli primer antikor solüsyonu ile kaplayarak primer antikor ile inkübe edin. Slaytları nemlendirilmiş bir odada gece boyunca 4 °C'de inkübe edin. Kuluçka sırasında, kurumayı önlemek için slaytlar küçük bir parça parafin filmi ile kaplanabilir.
- Ertesi sabah slaytları PBST ile 5 dakika 3 kez yıkayın.
- Biyotinile edilmiş ikincil antikoru istenen konsantrasyona seyreltmek için bloke edici çözeltiyi kullanarak ikincil antikor çözeltisini (iki slayt için 500 μL) hazırlayın (ör., 1 μL eşek anti-fare antikoru veya eşek anti-tavşan antikoru 499 μL bloke edici çözeltiye). Çözelti kullanılana kadar buz üzerinde saklanmalıdır.
- PBST'yi slaytlardan silkeleyerek ve bunları hızlı bir şekilde yeterli ikincil antikor çözeltisi ile kaplayarak ikinci antikor ile inkübe edin. Slaytları RT.
'de 1 saat nemlendirilmiş bir odada inkübe edin
not: Endojen biyotin bir endişe ise, biyotinile edilmiş ikincil antikor yerine peroksidaz konjuge ikincil antikor kullanın. Adım 1.10'da peroksidaz konjuge ikincil antikor kullanıyorsanız adım 1.14'e atlayın.
- Slaytları PBST ile 5 dakika 3 kez yıkayın.
- Yaban turpu peroksidaz konjuge streptavidin (SA-HRP) çözeltisini (iki slayt için 500 μL) 499 μL PBS'ye 0,5 μL SA-HRP ekleyerek hazırlayın. Nihai konsantrasyon 1 μg/mL'dir.
- SA-HRP solüsyonu ile inkübe edin. PBST'yi slaytlardan silkeleyin ve slaytları yeterli SA-HRP solüsyonu ile hızlı bir şekilde kapatın. Slaytları RT'de 0,5 saat nemlendirilmiş bir odada inkübe edin.
- Slaytları PBST ile 5 dakika 3 kez yıkayın.
- Florofor-tiramid çözeltisini, florofor-tiramidi üreticinin talimatlarına göre seyreltme tamponu ile seyrelterek hazırlayın (örn., 5 μL florofor-tiramid 496 μL seyreltme tamponuna).
- Slaytlardan PBST'yi silkeleyerek ve slaytları yeterli florofor-tiramid çözeltisi ile hızlı bir şekilde kaplayarak florofor-tiramid ile sinyal geliştirmeyi gerçekleştirin. RT'de nemlendirilmiş bir odada 1 dakika inkübe edin. İstenilen floresan yoğunluğunu elde etmek için inkübasyon süresi ayarlanabilir. Slaytları PBST içeren bir Coplin kavanozuna aktararak reaksiyonu durdurun. Slaytları PBST ile 3 dakika 2 kez yıkayın.
- Bu aşamada sonucu doğrulamak için sinyaller bir floresan mikroskobu altında hızlı bir şekilde kontrol edilebilir. Lamel kullanılmıyorsa, numuneleri nemli tutmak için her bölüme bir damla gliserol:PBS (1:1) uygulayın. Slaytları PBST ile 3 dakika 2 kez yıkayın. Slaytlar, bir sonraki adıma geçmeden önce birkaç gün boyunca PBST'de 4 °C'de saklanabilir.
2. İlk Antikoru Çıkarın
- Slaytları 275 mL kaynar sodyum sitrat çözeltisine (10 mM, pH = 6.0) en az 8 dakika yerleştirin. Slaytları kapaklı 14 x 9,5 x 9 cm3 (G x U x Y) pipet ucu kutusunun altına düz bir şekilde yerleştirerek ve çözeltiyi 70 W'lık bir mikrodalga fırında %700 güçte 8 dakika mikrodalgada pişirerek çözeltiyi kaynatın. Daha uzun bir sıyırma süresi tercih edilirse, slaytları her zaman tampon çözeltisine batırılmış halde tutmak için kaynayan bir sodyum sitrat çözeltisi kullanılarak tamponun doldurulması gerekebilir. Pipet ucu kutusunu mikrodalga fırından çıkarın, kapağı açın ve çözeltinin RT'de en az 20 dakika soğumasını bekleyin.
- Slaytları PBST içeren bir Coplin kavanozuna aktarın. PBST ile 5 dakika 3 kez yıkayın. Bir sonraki adım hemen gerçekleştirilmezse, slaytları PBST ile RT'de birkaç saat veya 4 °C'de 1-2 gün boyunca bir Coplin kavanozunda saklayın.
3. İkinci Antikor ile Leke
- Engelleme adımından başlayın ve adım 1.5 ile adım 1.14 arasındaki prosedürleri izleyin. Sinyal geliştirme adımlarında (adım 1.15 ve adım 1.16), florofor-tiramidi farklı bir floresan spektrumunda kullanın.
not: Slaytlar, multipleks boyamaya izin vermek için bu yöntem kullanılarak birkaç kez sıyrılabilir. Son antikor, raportör olarak florofor-tiramid gerektirmez. Son primer antikordan gelen sinyalleri göstermek için floroforla konjuge edilmiş bir sekonder antikor kullanılabilir.
- Nükleer karşı boyama gerekiyorsa, slaytları 2 μg / mL 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) veya Hoechst çözeltisi ile RT'de 1 dakika inkübe edin. Ardından slaytları PBST ile 3 dakika 2 kez yıkayın.
