$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir
1. Tümör infiltre eden lenfositlerin (TIL'ler) Yerinde İmmünofloresan Boyanması
- Prosedürel yönergeler
- Tüm deneysel adımları oda sıcaklığında gerçekleştirin.
- Tüm adımlar için, seyreltmeleri Tris Buffer Salin (TBS; bkz. Malzeme Tablosu) ile gerçekleştirin.
- Primer antikor inkübasyonundan sonra hariç tüm adımlar için TBS'de yıkamayı gerçekleştirin. İkincisi için, Tris Buffer Saline Tween20 kullanın (TBST, Malzeme Tablosuna bakınız). Tampon bileşimi ve sulandırma için Tablo 1'e bakınız.
- Antikor inkübasyonları için bir nem odası ve yıkamak için bir boyama kavanozu kullanın.
- İşlem sırasında bölümün kurumasına izin vermeyin.
- Ön arıtma
- Doku örneğini içeren slaytı çözün ve numunenin etrafındaki slaytı bir kağıt havluyla dikkatlice kurulayın. Dokuyu içeren reaksiyon alanını hidrofobik bir bariyer kalemle sınırlayın (bkz. Malzeme Tablosu). 2 dakika kurutun.
- Numuneleri 5 dakika boyunca %100 asetonda sabitleyin, 2 dakika kurutun ve 10 dakika TBS ile yıkayın.
- Doygunluk ve abluka
- Slaytları 10 dakika boyunca 3 damla avidin% 0.1 ile ön işlemden geçirin, avidini dağıtmak ve hava kabarcıklarını gidermek için slayta dokunun ve / veya hafifçe vurun ve ardından 10 dakika boyunca 3 damla biyotin% 0.01 ile tedavi edin (Malzeme Tablosuna bakınız), hafifçe vurun ve / veya hafifçe vurun. TBS ile yıkayın.
- Bir Fc reseptör blokajı gerçekleştirin. TBS'de seyreltilmiş% 5 hacim / hacim normal serumun 100 μL'sini uygulayın. Etiketli ikincil veya üçüncül antikorla aynı konakçı türden serum kullanın (bkz. Malzeme Tablosu); Burada eşek serumu kullanıldı. 30 dakika inkübe edin.
- İnkübasyon sırasında, anti-CD8, program hücre ölümü proteini 1 (PD-1) ve T hücresi immünoglobulin ve müsin içeren protein-3 (Tim-3) antikorlarını kısaca döndürün (Malzeme Tablosu). TBS'deki primer antikorların karışımını Tablo 2'de tarif edildiği gibi hazırlayın.
- CD8, PD-1 ve Tim-3 için immüno-boyama
- Birincil antikor karışımını hazırlayın. Kullanılan antikorlar (anti-CD8, PD-1, Tim-3 ve bunlara karşılık gelen ikincil antikorlar) ve konsantrasyonları için Malzeme Tablosu ve Tablo 2'ye bakın.
- Kalan eşek serumuna dokunun ve/veya hafifçe vurun (adım 1.3.2'de eklenmiştir). Slaytları, nemlendirilmiş bir odada 1 saat boyunca 100 μL etiketlenmemiş primer antikor karışımı ile inkübe edin.
- Kuluçka sırasında, Siyanin 5 anti-tavşan, Alexa Fluor 488-anti-keçi ve biyotinile anti-fare antikorlarını kısaca döndürün ve Tablo 2'de tarif edildiği gibi ikincil antikorların karışımını hazırlayın.
- Slaytları TBST'de 5 dakika yıkayın. Slaytları kurutun.
- Slaytları 100 μL ikincil antikorlarla nemlendirilmiş bir odada 30 dakika inkübe edin.
- Tablo 2'de tarif edildiği gibi Siyanin 3-streptavidin içeren üçüncül antikorların karışımını hazırlayın.
- Slaytları TBS'de 10 dakika yıkayın. Slaytları kurutun.
- Slaytları 100 μL üçüncül antikor karışımı ile 30 dakika inkübe edin.
- Slaytları TBS'de 10 dakika yıkayın. Slaytları kurutun.
- Hücre montajı
- Slaytları 4', 6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroklorür (DAPI) içeren bir montaj ortamına (1.5 μg / mL DAPI) floresan mikroskobu için uyumlu bir lamel ile monte edin (bkz. Malzeme Tablosu).
not: Her deney için negatif bir kontrol olarak, karşılık gelen antikorlarla aynı konsantrasyonda izotip uyumlu antikorlara sahip bir slayt kullanıldı. Bu boyama için fare IgG1, tavşan IgG ve keçi IgG-negatif kontrol antikorları kullandık (bkz. Malzeme Tablosu). Pozitif bir kontrol olarak, her deney için test edilen belirteçler için pozitif olduğu bilinen insan hiperplazik bademciklerini kullandık. Sonuçlarda tipik bir boyama tarif edilmiştir (Şekil 1). CD8, PD-1 ve Tim-3'ün mono boyanması, aynı ön işlemle ve DAPI olmadan ayrı ayrı (slayt başına bir boyama) yapılmalıdır. Aynı deney koşullarında herhangi bir antikor içermeyen ve sadece bir DAPI montaj ortamı olan bir slayt da gerçekleştirilmelidir. Bir slayt, herhangi bir antikor olmadan ve DAPI olmadan aynı deneysel koşullar kullanılarak görüntülenmelidir.
>2. Floresan Analizi ve Otomatik Hücre Sayımı
- Otomatik mikroskop ile görüntü elde etme
- Bir protokol oluşturun.
- Otomatik mikroskop yazılımını ve floresan aydınlatıcıyı açın.
- Menü çubuğunda "Dosya", "Protokol oluştur"a tıklayın, "DAPI", "FITC" ve "TRITC"yi seçin.
- "İleri", "Doku bölümü" ve "İleri", "Protokol adı" nı tıklayın. Bir ad seçin, örneğin "CD8-PD-1-Tim-3", "İleri" ve "Kaydet" i tıklayın.
- Sahne alanına manuel olarak bir slayt yerleştirin.
- Menü çubuğunda "kurulum" ve "ayarlar" ı tıklayın. Yeni pencerede "Ev Z'yi ayarla" yı tıklayın.
- Pozitif bir kontrol slaytı, yani bir DAPI örneği ile üçlü boyanmış bir CD8, PD-1 ve Tim-3 ile pozlama süresini ayarlayın.
- Kontrol çubuğunda, "pozlamayı ayarla" yı tıklayın.
- Yeterli ancak doygun olmayan bir sinyal elde edilene kadar her filtre için pozlama süresini ayarlayın.
- Tek renkli görüntüleme için aşağıdakileri gerçekleştirin:
Edinme'yi - seçin ve 'otomatik odaklama' altında DAPI filtresini seçin.
- "Tarama alanı sınırı"nda, hedefi slaytın sol üst köşesine taşıyın. "İşaretle" yi tıklayın. Sağ alt köşe için de aynısını yapın.
not: Bu adım, düşük güçlü görüntüleme (LP görüntüleme) alanını 4X'te sınırlar; Serinin tüm örneklerini çevrelemek için işareti iyi yerleştirdiğinizden emin olun.
- Yüksek güçlü (HP) görüntüleme için aşağıdakileri gerçekleştirin:
- 'Otomatik odaklama' altında "DAPI"yi seçin.
- 'Edinme' bandının altında "DAPI", "FITC", "Cy3" ve "Cy5"i seçin. "Tamam" ı tıklayın. Menü çubuğundaki "Dosya" ve "Protokolü kaydet" i tıklayın.
- Slaytları tarayın.
- Menü çubuğundan "Dosya" ve "Protokolü yükle" yi tıklayarak protokolü yükleyin. "Başlat" ı tıklayın.
- 'Lab ID' (Laboratuvar Kimliği) (görüntü depolama için klasör konumu) girin. Slaydı tanımlamak için Slayt Kimliği'ni girin. "İleri" ye tıklayın.
- "Monokrom Görüntüleme"ye tıklayın (tüm slaydı parlak alan ışığı altında taramak ve 4x objektif kullanarak sıralı görüntüler elde etmek için).
not: Bu, slaytın gri tonlamalı bir genel bakışını oluşturur.
- "Örnek Bul"a tıklayın. Düşük çözünürlükte (4x) taranacak doku alanını seçin: 'Ctrl' tuşunu basılı tutun ve alanları seçmek veya seçimlerini kaldırmak için imleci kullanarak bir alana tıklayın (Şekil 2A).
- Her alanın floresan Kırmızı Mavi Yeşil görüntü alımı için "LP Görüntüleme"ye (4x görüntüleme) tıklayın.
- HP alan seçimi için, 'Ctrl' tuşunu basılı tutun ve yüksek çözünürlükte (20x) taranacak doku alanına karşılık gelen alanları seçmek veya seçimini kaldırmak için imleci kullanarak bir alana tıklayın. 5 alan seçin (Şekil 2B).
- Her alanın multispektral görüntü alımı için "HP Imaging"e (20x görüntüleme) tıklayın (Şekil 2C).
- Görüntüleri LabID.
'da başlangıçta seçilen klasörde saklamak için "Veri Depolama"ya tıklayın
not: Süreç Şekil 2'de özetlenmiştir ve gösterilmiştir. Her adım için (doku algılama, alan seçimi), tam otomatik bir tarama işlemi için kullanıcı tarafından bir algoritma artırılabilir ve eğitilebilir.
Tablo 1: TBS ve TBST'nin tampon bileşimi. TBS, antikor karışımları ve seyreltmeler için kullanılır. Yıkamalar için, TBST'nin önerildiği primer antikorları takip eden yıkamalar dışında tüm adımlar TBS ile gerçekleştirilir.
| Tbs | TBST (Türkçe) |
| Tris-HCl | 0,05 milyon | 0,05 milyon |
| NaCl (Doğal) | 0,15 milyon | 0,15 milyon |
| Ara 20 | - | %0,05 |
| Ph | 7,6 | 7,6 |
| hazırlık | 1 tablet |
Tablo 2: CD8-PD-1-Tim-3 immünofloresan boyama için ayrıntılı antikor karışım bileşimi. Her birincil, ikincil ve üçüncül antikor karışımı için, karşılık gelen TBS hacminde gerçekleştirilecek seyreltme, toplam 1 mL'lik bir hacim için verilir. Bir slayt için, 2cm2'lik bir doku alanı için toplam reaksiyon hacmi 100 μL'dir.
| >Primer antikorun hacmi | Son V= 1 mL |
| Tavşan anti-CD8 | Fare anti-PD-1 | Keçi anti-Tim-3 | Tbs |
| 1,6 μL | 2 μL | 30 μL | 966,4 μL |
| İkincil antikorun hacmi | |
| Camgöbeği 5 anti-tavşan | Biyotinile anti-fare | Alexa Fluor 488 keçi karşıtı | Tbs |
| 3,3 μL | 2 μL | 2,5 μL | 992,2 |
| Tersiyer antikorun hacmi | |
| Cy3 etiketli streptavidin | | Tbs |
| 3,3 μL | | 996,7 |
