Enfekte Hücrelerde Viral Protein Lokalizasyonu için Bir İmmünofloresan Tekniği

Özet

Kaynak: Samrat, SK ve diğerleri, İmmünofloresan Konfokal Mikroskopi ile Herpes Simpleks Virüsü 1 Proteininin Nükleer-sitoplazmik Translokasyonunun Zamansal Analizi.J. Vis. Uzm.(2018)

Bu video, herpes simpleks virüsü-1 enfeksiyonunda enfekte hücre proteini 0, ICP0 trafiğini izlemek için bir yöntem göstermektedir. Post-de novo sentez, ICP0 çekirdeğe yer değiştirir ve daha sonra enfeksiyon ilerlemesi sırasında sitoplazmaya hareket eder. İmmünofloresan mikroskobu, proteinin hücre altı lokalizasyonunu ortaya çıkarır ve analiz ederek, enfeksiyon aşamaları boyunca kaçakçılığına ilişkin içgörüler sunar.

Protokol

1. Hücre Tohumlama ve Virüs Enfeksiyonu

1. Virüs enfeksiyonundan 20-24 saat önce, insan embriyonik akciğer (HEL) fibroblast hücrelerinin veya diğer hücrelerin 5 x 10⁴ tohumu, büyüme ortamında 4 oyuklu 11 mm'lik kademeli bir slayt üzerinde incelenecek (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiştir). Hücreleri 37 °C'de %5 karbondioksit (CO₂) ile inkübe edin.
   not: Her kuyucuk enfeksiyon anında% 70-80 hücre birleşmesine sahip olmalıdır.
2. Ertesi gün, büyüme ortamını çıkarın ve hücreleri Orta-199'da 4-10 pfu / hücre aralığında virüslerle enfekte edin. Virüsle enfekte olmuş hücreleri 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. Kuluçka süresi boyunca slaytı sallamaya devam edin.
3. 1 saatlik inkübasyondan sonra, Medium-199'u çıkarın ve büyüme ortamı ile takviye edin.
   not: Farklı enfeksiyon aşamalarına müdahale eden ilaçlar bu adımda veya viral emilimden önce eklenebilir.
4. Virüsle enfekte olmuş hücreleri, çeşitli enfeksiyon süreleri boyunca% 5 CO₂ ile 37 ° C'de inkübe edin.

2. Fiksasyon ve Geçirgenlik

1. Uygun enfeksiyon zamanında, enfekte olmuş hücreleri 3 kez fosfat tamponlu salin (PBS) ile hızlı bir şekilde yıkayın ve PBS'de taze hazırlanmış 200 μL% 4 paraformaldehit ekleyin. Hücreleri her bir oyuğa sabitlemek için hücreleri oda sıcaklığında 8-10 dakika paraformaldehit ile inkübe edin.
2. Paraformaldehiti aspire edin ve kuyuları 3 kez 200 μL PBS ile yıkayın. 3. yıkamadan sonra PBS'yi tamamen aspire edin.
3. Hücrelere 5-10 dakika boyunca nüfuz etmek için her oyuğa 100 μL %0.2 iyonik olmayan yüzey aktif madde ekleyin.
4. İyonik olmayan yüzey aktif maddeyi aspire edin ve kuyucukları 200 μL PBS ile 3 kez yıkayın.

3. İmmünofloresan Boyama

1. PBS'yi tamamen aspire edin ve her bir oyuğa 200 μL bloke edici tampon (PBS'de% 1 sığır serum albümini (BSA) ve% 5 at serumu) ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
2. Enfekte hücre proteini 0'a (tavşan anti-ICP0 poliklonal antikoru) karşı deneysel olarak belirlenmiş birincil antikor konsantrasyonunu bloke edici tampona ekleyin ve birincil antikoru oda sıcaklığında 2 saat veya gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
3. 10 dakika inkübasyon ile 3 kez bloke edici tampon ile yıkayın. Alexa 594 konjuge keçi anti-tavşan ikincil antikoru (1:400 bloke edici tamponda seyreltilmiş) ekleyin ve slaytları oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Daha sonra slaytları 10 dakika aralıklarla blokaj tamponu ile 3 kez yıkayın.
4. Son olarak, kalan BSA ve at serumunu çıkarmak için slaytı PBS ile bir kez yıkayın.
5. Slaytı monte etmek için 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile bir damla antifade montaj ortamı ekleyin ve şeffaf oje kullanarak lamel ile kapatın.

4. Konfokal Görüntüleme

1. Konfokal bir mikroskopla, dalga boyunu Alexa 594 için 590-650 nm ve DAPI için 410-520 nm olarak ayarlayın. Yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmek için 1024 x 1024 görüntü formatını ve satır ortalaması 8'i seçin.
2. Konfokal mikroskop altında 4 oyuklu slayttaki her bir kuyucuğu analiz edin. Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterildiği gibi 100X hedefi altında temsili hücre görüntüleri elde edin.
3. Çok sayıda hücreyi saymak için, 40X hedefi altında ardışık alanların resimlerini çekin.
   not: Her enfeksiyonun her zaman noktasından 200'den fazla enfekte hücre biriktirmek için 5-10 görüntü gerekir.
4. Her deneyde, karşılaştırılması gereken tüm numuneler için sabit konfokal parametrelerle resimler çekin.

5. Nükleer ve Sitoplazmik Dağılımın Analizi

1. Konfokal uygulama yazılımı ile projeyi açın. ICP0'ın nükleer ve sitoplazmik dağılımı için hücrelerin tablo haline getirilmesi gereken bir görüntü seçin.
2. Üst menüden "Miktar" sekmesine tıklayın ve araçlar menüsünden "ROI'leri sırala" yı seçin.
3. Üst menüden "Çizgi çiz" i seçerek analiz edilecek hücre boyunca uzunlamasına bir çizgi çizin.
   not: Hem ICP0 hem de DAPI için çizgi boyunca floresan yoğunluğunu gösteren histogram görünecektir. Histogramda mavi çizgi DAPI piksellerini temsil eder ve çekirdeğin sınırını işaretlerken kırmızı çizgi ICP0 piksellerini temsil eder.
4. Arka plan boyamaya bağlı olarak, her deneyde ICP0 hücre altı dağılımını analiz etmek için ICP0 yoğunluğu için sabit bir eşik ayarlayın.
   1. Şekil 2'de örneklendiği gibi, kırmızı sinyal ortalama olarak nükleer bölgede eşiğin altındaysa, ancak mavi sınırın ötesinde eşiğin üzerindeyse, kırmızı sinyali ağırlıklı olarak sitoplazmada bulunan olarak sınıflandırın.
   2. Kırmızı sinyal çekirdek boyunca eşiğin üzerindeyse ve mavi sinyalin sınırının ötesindeyse, kırmızı sinyali çekirdek artı sitoplazmik lokalizasyon olarak gruplandırın.
   3. Kırmızı sinyal çekirdekteki eşiğin üzerindeyse, ancak ortalama olarak mavi sinyalin sınırının dışındaysa, kırmızı sinyali nükleer lokalizasyon olarak gruplandırın.
5. Her numuneden farklı enfeksiyon zamanlarında 200'den fazla enfekte hücreyi tablo haline getirin ve zamana göre ICP0 hareketini göstermek için çubuk grafikte çizin (Şekil 3).

Sonuçlar

Şekil 1: HSV-1 enfeksiyonu sırasında dinamik ICP0 kaçakçılığı.4 oyuklu slaytlar üzerinde büyütülen HEL hücreleri, 10 pfu / hücrede prototip HSV-1 (fuş F) ile enfekte edildi. Enfeksiyondan 1, 5 ve 9 saat sonra (hpi), hücreler sabitlendi, geçirgen hale getirildi ve tavşan anti-ICP0 ve fare anti-PML birincil antikorlarına reaksiyon gösterdi ve daha sonra Alexa 594 konjuge anti-tavşan ve Alexa 488 konjuge...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Hücreler ve virüsler
İnsan Embriyonik Akciğer fibroblastları (HEL Hücreleri)	Dr. Thomas E. Shenk (Princeton Üniversitesi)		HEL hücreleri, %10 FBS ile desteklenmiş DMEM'de büyütüldü
HSV-1 viral Stok (Suş F)	Dr. Bernard Roizman Laboratuvarı
Orta
Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's medium (DMEM)	Canlandırıcı	11965-092
Fetal Sığır Serumu (FBS)	Sigma	F0926-500ml
Orta-199 (10X)	Gibco (Gibco)	11825-015
Reaktif
4- Kuyu 11 mm kademeli sürgü	Cel-Line/Thermofisher Bilimsel	30-149H-SİYAH
% 16 Paraformaldehit çözeltisi (a / h) Metanol içermez	Termo Bilimsel	28908
Triton X-100	Fisher reaktifleri	BP151-1C0
Sığır Serum Abumin (BSA)	Calbiochem (Kireç Biyokimyası	CAS 9048-46-8
At Serumu	Sigma	H1270
Fosfat Tamponlu Tuzlu Serum Fizyolojik (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4)	Dr. Haidong Gu laboratuvarı
NaCl (Doğal)	Fisher Biyoreaktif	BP358-212
KH2PO4	Fisher Biyoreaktif	BP362-500
Kartal	Balıkçı Bilimsel	BP366-500
Na2HPO4	Fisher Biyoreaktif	BP332-500
Bloke edici tampon (% 1 BSA ve% 5 At serumu içeren PBS)	Dr. Haidong Gu laboratuvarı
Rabiit Anti-ICP0 antikoru	Dr. Haidong Gu laboratuvarı
PML (PG-M3)-Fare monoklonal IgG	Santa Cruz Biyoteknoloji	SC-966 Serisi
Alexa Fluor 594-keçi anti-tavşan IgG	Canlandırıcı	A11012
Alexa Fluor 488-keçi anti-fare IgG	Canlandırıcı	A11001
DAPI ile Vectashield Nemlendirme ortamı	Vektör laboratuvarları	H-1200
Pasteur pipeti	Balıkçı Markası	13-678-20D
oje	Sally Hansen ·
ekipman
Konfokal Mikroskop	Leica SP8
Konfokal Yazılım	Leica LAS X Uygulama paketi
Excel yazılımı	Microsoft Excel
HERAcell 150i CO2 inkübatörü	Termo Bilimsel	Sipariş kodu 51026282