Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Cerrahi eksizyon ve doku hazırlığı
- İntraperitoneal olarak 1 mL tribromoetanol enjekte ederek fareyi ötenazi yapın (standart protokole göre hazırlanır; Malzeme Tablosu).
not: CO2 boğulması, akciğer hasarına neden olabileceği ve akciğer bağışıklık hücrelerinin özelliklerini ve özelliklerini değiştirebileceği için akciğer çalışmalarında kaçınılmalıdır. Akciğerde mekanik yaralanmaya neden olabileceğinden servikal çıkıktan da kaçınılmalıdır.
- Fareyi cerrahi işlem için temiz ve özel bir alana aktarın.
- Dört ekstremitede iğne veya bant kullanarak farenin sırt tarafı aşağı bakacak şekilde sabitleyin. Ventral bölgenin cildini sterilize etmek için% 70 etanol kullanın.
- Boyundan karına kadar deride bir kesi yapın. Cildi torasik bölgeden dikkatlice çıkarın.
- Sternumu ve kaburgaları dikkatlice çıkarın.
- Akciğerler tamamen beyaz olana kadar 18-21 G'lik bir iğne kullanarak doğrudan sağ ventriküle 10 mL soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) enjekte ederek akciğerleri yıkayın.
- Akciğerlere dokunmadan timüs ve kalbi dikkatlice çıkarın.
- Akciğerleri çevre dokulardan nazikçe ayırın ve soğuk sığır serum albümini (BSA) tamponu olan bir tüpe aktarın (Tablo 1).
not: Tek hücreli süspansiyonu daha fazla hazırlamadan önce akciğerlerdeki tüm bitişik yağları çıkarmak için çaba gösterilmelidir, çünkü bu, okumaları saptırabilir.
2. Tek hücreli süspansiyonun hazırlanması
- Akciğerleri boş bir Petri kabına aktarın ve iki ince neşterle kıyın. Kıyılmış akciğerin tüm parçalarını 50 mL'lik yeni bir konik tüpe aktarın. Plakayı yıkamak için 5 mL sindirim tamponu kullanın ve kıyılmış akciğeri içeren 50 mL tüpe ekleyin (Tablo 1).
not: Sindirim tamponu kullanımdan hemen önce hazırlanmalıdır. 5 mg / mL kollajenaz kullanın. 1 veya 5 mg kollajenazın BSA tamponu veya proteinsiz PBS ile birleştirilmesi sonuçları iyileştirmedi (Şekil 1).
- Tüpün kapağını sabitleyin ve akciğeri 37 ° C'de 150 rpm hızında bir orbital çalkalayıcı üzerinde 30 dakika boyunca sindirin. 10 mL soğuk BSA tamponu ekleyerek reaksiyonu durdurun.
- Sindirimden sonra, akciğer parçalarını karıştırmak ve çözmek için 18 G'lik bir iğne kullanın. Yeni 50 mL'lik konik borunun üstüne 70 μm'lik bir filtre süzgeci yerleştirin.
not: Daha küçük bir mikron filtrenin kullanılması, majör miyeloid popülasyonlarının kaybına neden olabilir.
- Sindirilmiş akciğer karışımını yavaşça doğrudan süzgecin üzerine aktarın. Filtrede kalan akciğer parçalarını parçalamak için 10 mL'lik bir şırınga pistonunun kauçuk tarafını kullanın. Filtredeki işlenmiş malzemeyi BSA tamponu ile yıkayın.
- Tek hücreli süspansiyonu 350 × g'da 4 °C'de 8 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı dikkatlice atın ve hücreleri 1 mL amonyum-klorür-potasyum (ACK) lizis tamponunda yeniden süspanse edin. 1 mL'lik bir pipet kullanarak iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 90 saniye inkübe edin.
- Reaksiyonu durdurmak için 10 mL soğuk BSA tamponu ekleyin ve 4 ° C'de 7 dakika boyunca 350 × g'da santrifüjleyin.
- Hücreleri 5 × 106 hücre/mL konsantrasyonda yeniden süspanse edin ve yüzey boyama için kullanın (bkz. bölüm 2).
not: Bu amaçla, hücreleri 96 oyuklu yuvarlak tabanlı bir plakaya yerleştirin, ardından antikor boyama ve yıkama yapın. Plakalı santrifüj mevcut değilse, plakalar yerine akış tüpleri kullanın. Bu protokol ile ortalama büyüklükte 6-10 haftalık bir C57BL/6 fareden akciğer başına ~15-20 × 106 hücre elde edilebilir.
3. Yüzey antikoru boyama
- 96 oyuklu bir plakada kuyucuk başına 200 μL'de 1 ×10 6 hücre aktarın. Plakayı 350 × g'da 4 °C'de 7 dakika santrifüjleyin. Bu arada, anti-16/32 antikorunu (1:100) boyama tamponunda seyrelterek Fc blok çözeltisini hazırlayın (Tablo 1).
- Hücreleri önceden hazırlanmış Fc bloke etme çözeltisinin (Malzeme Tablosu) 50 μL'sinde yeniden süspanse edin ve 4 ° C'de veya buz üzerinde 15-20 dakika inkübe edin.
- 150 μL boyama tamponu ekleyin ve plakayı 350 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Bu arada, yüzey antikorlarını seyrelterek yüzey antikor kokteylini hazırlayın (1:100; Tablo 2) boyama tamponunda.
NOT: (i) Fc blokajı için anti-16/32 antikoru, aynı karışımdaki yüzey antikorları ile birlikte kullanılabilir. (ii) Sabitlenebilir canlılık boyası kullanılıyorsa, 1: 1.000 seyreltmede yüzey antikor kokteyline ekleyin.
- Hücreleri önceden hazırlanmış yüzey antikor kokteylinin 50 μL'sinde yeniden süspanse edin ve karanlıkta 4 ° C'de 30-40 dakika inkübe edin. Hücreleri boyama tamponu ile iki kez yıkayın.
not: Hücre içi boyama gerekmiyorsa, hücreleri 200 μL boyama tamponunda yeniden süspanse edin ve doğrudan akış sitometresinde veri toplamaya devam edin. Alternatif olarak, hücreler daha sonra elde edilmek üzere sabitlenebilir ve 4 ° C'de saklanabilir. Hücrelerin 24 saat içinde akış sitometrisi için kullanılmasını öneririz.
4. Hücre fiksasyonu ve hücre içi boyama
- FoxP3/Transkripsiyon Faktörü Boyama Tamponu Setinin üç kısım fiksasyon/geçirgenleştirme konsantresi ve 1 kısım fiksasyon/geçirgenlik seyrelticisini karıştırarak fiksasyon/geçirgenleştirme tamponunu (Fix/Perma Tamponu) hazırlayın (Tablo 1).
- Hücreleri, hücrelerin bölüm 3'te tarif edildiği gibi kaplandığı 96 oyuklu plakanın oyuğu başına önceden hazırlanmış Fix / Perma Tamponunun 50 μL'sinde yeniden süspanse edin ve karanlıkta 4 ° C'de 20-25 dakika inkübe edin.
- 1x geçirgenleştirme tamponu hazırlamak için 10x geçirgenlik tamponunu arıtılmış deiyonize su içinde 1: 10 oranında seyreltin.
- Hücreleri 1x geçirgenlik tamponu ile bir kez yıkayın. Bu arada, hücre içi antikorları (1:100) 1 mL geçirgenlik tamponunda seyrelterek hücre içi antikor kokteylini hazırlayın.
- 96 oyuklu plakanın hücresi başına 50 μL önceden hazırlanmış yüzey antikor kokteyli kullanarak hücreleri yeniden süspanse edin ve karanlıkta 4 ° C'de 40 dakika inkübe edin.
- Hücreleri bir kez geçirgenlik tamponu ile ve bir kez boyama tamponu ile yıkayın. Son yıkamadan sonra, hücreleri 200 μL boyama tamponunda yeniden süspanse edin.
not: Plaka okuyuculu bir akış sitometresi yoksa, hücreleri akış sitometri tüplerine aktarın.
- Akış sitometresinde numune başına en az 1,5 × 106 hücre edinin.
not: Tek renkler ve lekesiz kontrol numuneleri için numune başına 0,5-1 × 106 hücre yeterli olacaktır. Optimal boyamayı elde etmek ve maliyetleri azaltmak için kullanılan bireysel antikorların titrelenmesi önerilir. Mevcut protokol, FoxP3 boyama tampon seti kullanılarak hazırlanan Fix/Perm Buffer kullanılarak optimize edilmiştir. CD68 bir nükleer belirteç değil sitoplazmik olduğundan, çeşitli satıcılardan düşük konsantrasyonda paraformaldehit veya sitofik/sitoperm kitleri gibi diğer geçirgenleştirme çözümleri yeterli olabilir.
Tablo 1: Arabellekler.
| BSA arabelleği | PBS +% 0.5 Sığır serum albümini |
| Sindirim tamponu | Önceden ısıtılmış (37 °C) BSA tamponu + 5 mg/mL kollajenaz tip 1 + 0.2 mg/mL DNaz I |
| Boyama tamponu | PBS +% 2.5 FBS |
| Düzeltme/İzin Tamponu | Foxp3/Transkripsiyon Faktörü Boyama Tampon Setinin üç kısım fiksasyon/geçirgenlik seyrelticisi ve 1 kısım fiksasyon/geçirgenlik seyrelticisi |
| Geçirgenlik tamponu | Arıtılmış deiyonize suda 10 kez seyreltilmiş Foxp3 / Transkripsiyon Faktörü boyama Tampon Setinden 10x geçirgenlik tamponu |
Tablo 2: Monoklonal antikorların kullanımı.
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
)
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
)
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
| Antijen | Klon | Florokrom | Seyreltme | Yüzey/hücre içi |
| CD45 | 30-F11 | APC/CY7 | 1:100 | yüzey |
| Gr-1 | RB6-8C5 | BV421 | 1:100 | yüzey |
| CD68 | FA-11 (Türkçe | PerCPCy5.5 | 1:100 | hücre içi |
| CD11b | M1/70 | PECy7 | 1:100 | yüzey |
| Siglec F | S17007L | FITC (Finans Finans Kurumu) | 1:100 | yüzey |
| CD11c (İngilizce) | N418 | BV650 veya BV510 | 1:100 | yüzey |
| CD64 | X54-5/7.1 | PE/Göz Kamaştırıcı 594 | 1:100 | yüzey |
| MHC-II | M5/114.15.2 | AF700 | 1:100 | yüzey |
| CD103 | 2.00E+07 | PE / FITC | 1:100 | yüzey |
| Canlı / Ölü Sabitlenebilir Uzak Okuma Ölü Hücre Leke Kiti | | FarRed (APC) veya Aqua (BV510) | 1:1000 | yüzey |
| CD3 (İngilizce | 17A2 | Pe | 1:100 | yüzey |
| B220 | RA3-6B2 | AF488 | 1:100 | yüzey |
| NK1.1 | PK136 | FITC (Finans Finans Kurumu) | 1:100 | yüzey |
| CD24 | 30-F1 | Pe | 1:100 | yüzey |
| MERTK (Türkçe) | 2B10C42 | Pe | 1:100 | yüzey |
| F4/80 | BM8 | BV605 | 1:100 | yüzey |
| CX3CR1 | SA011F11 | Pe | 1:100 | yüzey |
| Fc Blok (CD16/32) | 93 | | 1:100 | yüzey |
