$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
>1. Kriptokok hücrelerinin hazırlanması
- Test organizmasını bir aşılama halkası ile steril bir maya-malt-özü (YM) agar plakasına yerleştirin.
- Agar plakasını 30°C'de 48 saat inkübe edin.
- 5 tek koloniyi kepçelemek için bir aşılama halkası kullanın ve bunları 5 mL steril damıtılmış suda askıya alın.
- RPMI-1640 ortamının mL başına 0,5 ×ila 105 × 2,5 ila 105 koloni oluşturan birim (CFU) arasında bir hücre konsantrasyonu elde etmek için hücreleri bir McFarland standardı kullanarak hücreleri standartlaştırın.
- 100 μL'lik bir hücre süspansiyonunu, tohumlanmış makrofajlar içeren mikrotitre plakalarının kuyularına dağıtın (aşağıdaki bölüme bakınız).
2. Makrofajların hazırlanması
- 20 mg / mL streptomisin, 2 mM L-glutamin, 20 U / mL penisilin ve% 10 fetal sığır serumu ile desteklenmiş 10 mL RPMI-1640 ortamı içeren bir doku şişesi üzerinde bir murin makrofaj hücre hattı olan RAW 264.7'yi yetiştirin.
- Şişeyi, %80 birleşme elde edilene kadar 37°C'ye ayarlanmış %5 CO2 inkübatöre yerleştirin.
- Bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri nazikçe kazıyın.
- Askıdaki hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
- Hücre canlılığını belirlemek için tripan mavisi boyasını kullanın.
not: %85'in üzerinde bir canlılık skoru tercih edilir.
- 10 mL'lik taze, steril RPMI-1640 ortamı çözeltisi kullanarak makrofajların hücre konsantrasyonunu 1 ×10 6 hücre / mL'ye ayarlamak için bir hemositometre kullanın.
- 100 μL hücre süspansiyonunu steril 96 oyuklu düz tabanlı mikrotitre plakasının kuyularına dağıtın.
- Plakayı gece boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatörde inkübe edin
not: Kullanmadan önce, gece boyunca harcanan ortam aspire edilmeli ve 100 μL taze, steril Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) ortamı ile değiştirilmelidir.
3. Bileşik hazırlama
- Bir stok çözeltisi hazırlamak için test ışığa duyarlılaştırıcıları ve primakini (PQ) damıtılmış suda çözün.
- Bileşiği RPMI-1640 ortamında daha fazla seyreltin.
not: RPMI-1640 ortamındaki nihai damıtılmış su miktarı asla %1'i geçmemelidir.
- İstenilen konsantrasyonu önceden tohumlanmış makrofajları ve kriptokok hücrelerini içeren uygun kuyucuklara dört katına çıkarmak için hazırlanan ışığa duyarlılaştırıcının 100 μL'lik bir çözeltisini dağıtın.
4. Fotodinamik tedavinin (PDT) uygulanması
- Aşağıdaki deneysel koşulları ayarlayın:
- 0 μM PQ ile kokültürlenmiş ve 2 dakika boyunca koyu ışığa (DL) maruz bırakılmış hücreler (ör., tedavi edilmemiş (Rx olmayan) hücreler)
- 6 μM ile birlikte kültürlenmiş hücreler ve 2 dakika boyunca DL'ye maruz bırakılır (ör., ilaç etkisi)
- 15 μM PQ birlikte kültürlenmiş hücreler ve 2 dakika boyunca DL'ye maruz bırakılmış (ör., ilaç etkisi)
- 30 μM PQ ile ko-kültürlenmiş hücreler ve 2 dakika boyunca DL'ye maruz bırakılmış (ör., ilaç etkisi)
- 0 μM PQ ile birlikte kültürlenmiş ve 2 dakika boyunca ultraviyole (UV) maruz bırakılmış hücreler (UV etkisi)
- 6 μM PQ ile birlikte kültürlenmiş hücreler ve 2 dakika boyunca ultraviyole ışığa (UVL) maruz bırakılmış hücreler (ör., PDT etkisi)
- 15 μM PQ ile birlikte kültürlenmiş ve 2 dakika boyunca UVL'ye maruz bırakılmış hücreler (ör., PDT etkisi)
- 30 μM PQ ile birlikte kültürlenmiş ve 2 dakika boyunca UVL'ye maruz bırakılmış hücreler (ör., PDT etkisi)
not: Birlikte kültürlenmiş hücrelerin, UVL'ye maruz kalmadan önce (uygun olduğu yerde) karanlıkta (uygun olduğunda) 30 dakika boyunca PQ ile reaksiyona girmesine izin verilmelidir.
not: Mevcut çalışmada, PQ'nun antiseptik lambanın UV aralığında olan 260 nm'lik bir UV/Vis absorpsiyonuna sahip olduğunu belirledik. İkincisi nedeniyle, PDT'yi uygulamak için bir ışık kaynağı olarak Sınıf II Biyolojik güvenlik kabinine yerleştirilmiş bir mikrop öldürücü ultraviyole C (UVC) lambası kullandık. Lambanın 30 watt nominal güce sahip olduğu bildiriliyor. Bu çalışmada hücreler lambadan yaklaşık 20 cm uzakta tutulmuştur. Bu mesafede, lambanın 625 μW/cm2'lik bir radyasyon çıkışına sahip olduğu tahmin edilmektedir.
5. Kriptokok hücrelerinin hayatta kalmasını belirlemek için kolonileri sayma
- Yukarıda belirtildiği gibi ko-kültürlenmiş hücrelerin fotodinamik işlemine başladıktan sonra, plakaları 18 saat boyunca% 5 CO2 içinde 37 ° C'de inkübe edin.
- 18 saat sonra, süpernatanı aspire edin.
- İçselleştirilmemiş hücreleri yıkamak için kuyuları 200 μL fosfat tampon çözeltisi (PBS) ile yıkayın. Bu adımı üç kez tekrarlayın.
- Kuyucuklara 300 μL% 0.1 Triton X-100 ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
- Kuyucukların içeriğini aspire edin ve steril 1,5 mL plastik tüplere dağıtın.
- Hücrelerin damıtılmış su ile 10'da 1'i oranında seyreltilmesini hazırlayın.
not: Seyreltmeyi, agar plakaları üzerinde 30 ila 300 koloni arasında geri kazanım mümkün olacak şekilde ayarlayın.
- 50 μL seyreltmeyi bir Maya Malt (YM) agar plakasına pipetleyin.
- Azar plakasının yüzeyinde hücrelerden oluşan bir birleşme çimi oluşturmak için bir yayılmış plaka yöntemi kullanın.
- Plakaları 30 ° C'de 48 saat inkübe edin.
- Azar plakaları üzerinde geliştirilen koloni oluşturan birimleri (CFU'lar) sayın.