Aspirin ve İbuprofen'in Makrofajların Fagositik Yeteneği Üzerine Etkisi

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu videoda, aspirin ve ibuprofen'in minimum inhibitör konsantrasyonlarında, pH'a duyarlı floresan boya lekeli mantar hücreleri kullanılarak makrofaj fagositozu üzerindeki etkisini değerlendirmek için bir yöntem gösterilmektedir. İlaçlar, pH'a duyarlı boyanın floresan ölçümlerinde gözlemlendiği gibi, siklooksijenaz-2'yi inhibe eder, prostaglandin oluşumunu azaltır ve makrofaj fagositozunu artırır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Güvenlikle ilgili hususlar

Personel kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanmalıdır.
Patojen ve makrofajları Sınıf II Biyolojik güvenlik kabininde kullanın.

2. Makrofajların hazırlanması

20 mg / mL streptomisin, 2 mM L-glutamin, 20 U / mL penisilin ve% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş 10 mL Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) ortamı içeren bir doku şişesinde bir murin makrofaj hücre hattı olan RAW 264.7'yi yetiştirin.
Şişeyi, %80 birleşme elde edilene kadar 37°C'ye ayarlanmış %5 karbondioksit (CO₂) inkübatöre yerleştirin.
Bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri nazikçe kazıyın.
Askıdaki hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
Hücre canlılığını belirlemek için tripan mavisi boyasını kullanın.
not: %85'in üzerinde bir canlılık puanı tercih edilir.
10 mL'lik taze, steril RPMI-1640 ortamı çözeltisi kullanarak makrofajların hücre konsantrasyonunu 1 ×^{10 5} hücre / mL'ye ayarlamak için bir hemositometre kullanın. 100 μL hücre süspansiyonunu steril 96 oyuklu düz tabanlı mikrotitre plakasının kuyucuklarına dağıtın. Plakayı gece boyunca 37 ° C'de% 5 CO₂ inkübatörde inkübe edin.
not: Gece boyunca harcanan ortam aspire edilmeli ve kullanımdan önce 100 μL taze, steril RPMI-1640 ortamı ile değiştirilmelidir.

3. Kriptokok hücrelerinin hazırlanması

Test organizmasını bir aşılama halkası ile steril bir maya-malt-özü (YM) agar plakasına yerleştirin.
Agar plakasını 30°C'de 48 saat inkübe edin.
Bir aşılama döngüsü kullanarak, %4 glikoz ile desteklenmiş 100 mL maya nitrojen bazı (YNB) suyuna bir döngü dolusu hücre aşılayın.
30 ° C'de 160 rpm'de çalkalarken hücreleri (ön kültür) gece boyunca büyütün.
Ertesi gün, ön kültürün 0.1 mL'sini taze YNB suyuna (ana kültür) aşılayın ve hücrelerin orta üstel faza kadar (aynı yetiştirme koşulları altında) büyümesine izin verin.
Hücreleri fosfat tampon çözeltisi (PBS) ile iki kez yıkayın.
Bir hemositometre kullanarak, hücreleri PBS'de 1 x 10^5'e standardize edin.

4. Fagositoz boyası ile kriptokok hücrelerinin boyanması

Hücrelerin 999 μL'sini 1.5 mL'lik bir plastik tüpe dağıtın.
Aynı tüpe 1 μL pHrodo yeşil zymosan A lekesi ekleyin.
Hücreleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca, karanlıkta, leke ile reaksiyona girmek için yavaş çalkalama ile inkübe edin.
Kuluçka süresinin sonunda, hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.
Tohumlanmış makrofajlar içeren kuyucuklara 100 μL'lik bir hücre süspansiyonu dağıtın.

5. İlaçların hazırlanması

1000 mL mutlak etanolde 1 mg aspirin kullanarak 1000 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona kadar bir stok aspirin çözeltisi hazırlayın.
İstenen ilaç konsantrasyonlarına ulaşmak için bileşiği RPMI-1640 ortamında daha fazla seyreltin.
not: RPMI-1640 ortamındaki nihai etanol miktarı asla %1'i geçmemelidir. 1000 mL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 1 mg ibuprofen kullanarak bir ibuprofen stok çözeltisi hazırlayın. İstenen ilaç konsantrasyonlarına ulaşmak için bileşiği RPMI-1640 ortamında daha fazla seyreltin.
not: RPMI-1640 ortamındaki nihai DMSO miktarı asla %1'i geçmemelidir. Hazırlanan ilaçların istenen konsantrasyonların dört katında 100 μL'lik bir çözelti hazırlayın ve tohumlanmış makrofajlar ve kriptokok hücreleri içeren uygun kuyucuklara dağıtın.

>6. Kemo-duyarlılaştırıcı ajanların makrofaj fagositozu üzerindeki etkisi

Plakaları, kemo-duyarlılaştırıcı ajanlar, aspirin veya ibuprofen varlığında% 5 CO₂ inkübatörde 37 ° C'de 2 saat veya 6 saat boyunca ko-kültürlenmiş hücrelerle inkübe edin.
Kuluçka süresinin sonunda, indüklenen floresansı ölçün (örn: 492 nm ve em: 538 nm).
not: pHrodo boyası sadece fagozomun içi gibi asidik ortamlarda floresan yapar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Şirket

Katalog numarası

Yorumlar

Ağar

Merck