$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Hedef hücrelerin enfeksiyon için hazırlanması
- Deneyi gerçekleştirmeden bir gün önce hedef hücreleri 96 oyuklu bir plakada ('hedef' plaka) tohumlayın.
- Neredeyse birleşik (~% 90) bir tek tabaka sağlamak için kuyu başına yeterli hücreyi plakalayın.
not: Bu, hedef hücre tipinizin göreli boyutuna bağlı olacaktır. İnsan sünnet derisi fibroblastları (HFF'ler) kullanılıyorsa, 20.000 hücre / kuyu tohumlayın.
- Tipik olarak, numune başına 21 kuyu (7'ye 3 çapta) tohumlanmalıdır, bu da plaka başına 4 numunenin analiz edilmesine izin verir.
- Kontrol görevi görmesi için plaka başına 12 kuyu daha (yani sıra 8) tohumlayın.
2. Virüsün hazırlanması: antikor karışımları
- İstenen ilk test antikor konsantrasyonunun iki katını oluşturmak için antikorla birleştirilmiş (ve iyi karıştırılmış) 90 μL medyayı, taze bir 96 oyuklu plakanın ('seyreltme' plakası) 1. sıranın 3 oyuğuna ekleyin.
not: Tipik bir antikor başlangıç konsantrasyonu 20 μg/mL olacaktır, ancak ampirik olarak belirlenmelidir.
- Aşağıdaki 18 kuyucuğun her birine (yani, 6'ya 3 çapraz) 60 μL ortam ekleyin, adım 2.1'deki 3 kuyucuk.
- 12 ek kuyucuğa 60 μL ortam ekleyin (yani, satır 8).
- 30 μL antikor seyreltmesini 1. sıradan 2. sıradaki karşılık gelen kuyucuklara aktarın.
- Çok kanallı pipetle 20 kez yukarı ve aşağı düzgün bir şekilde pipetleyerek 2. sıranın içeriğini karıştırın.
- 30 μL antikor seyreltmesini 2. sıradan 3. sıraya aktarın.
- Bu karıştırma ve aktarma işlemini, 7. satırın içeriği karışana kadar tekrarlayın.
- Sıra 7 karıştırıldıktan sonra, 30. sıradaki kuyucuklardan 7 μL'yi atın.
- HCMV'yi tam bir ortamda seyreltin, böylece 50 μL, doğrudan hücrelere eklenirse MOI = 1 enfeksiyonuna neden olacak kadar yeterli bulaşıcı partikül içerir.
not: HCMV, Biyogüvenlik Seviye 2 (BSL-2) kategorisinde bir patojendir. Uygun güvenlik prosedürlerinin uygulandığından emin olun ve HCMV'ye maruz kalan tüm ortamlar için filtre uçları kullanın.
not: Bu, hücre tipine ve virüs tropizmine bağlı olarak değişecek olan hücre/kuyu ile aynı sayıda bulaşıcı parçacık gerektirir. Yukarıda tarif edildiği gibi HFF'ler kullanılıyorsa, gerekli virüs konsantrasyonu 4x105 pfu/mL'dir.
not: Yeterli miktarda seyreltilmiş virüs (örneğin, %10 fazla) hazırlandığından emin olun.
- Antikor dilüsyonları içeren tüm oyuklara ve sadece 60 μL ortam içeren 6 oyuğa 60 μL seyreltilmiş virüs stoğu ekleyin.
- Enfekte olmamış kontroller olarak hizmet etmek için yalnızca kalan 6 oyuğa yalnızca 60 μL ortam ekleyin.
- Elde edilen virüsü inkübe edin: 1 saat boyunca 37° C'deantikor karışımları.
3. Hedef hücrelerin enfeksiyonu
- Hedef hücrelerden tüm medyayı kaldırın.
- Çok kanallı bir pipet kullanarak, 100 μL virüs: antikor karışımını 'seyreltme' plakasından 'hedef' plaka üzerindeki eşdeğer konumdaki hücrelere aktarın.
- Hücreleri 37 ° C'de,% 5 CO2'de 24 saat inkübe edin.
4. Hücrelerin sabitlenmesi
- Cells.
dosyasından tüm ortamları kaldırın
not: Bu noktada kuyular arasında uç değiştirmeye gerek yoktur.
- Tüm kuyucukları 200 μL fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yıkayın ve çıkarın.
- Tüm kuyucuklara 180 μL -20 oC,% 100 etanol ekleyin.
- Plakayı -20 °C'de en az 30 min.
inkübe edin
not: Bu adım, buharlaşmaya başladığında ilave etanol eklenmesi koşuluyla en az bir aya kadar uzatılabilir.
not: Plakanın bu noktadan itibaren BSL-1 koşulları altında kullanımı güvenlidir ve filtresiz uçlar kullanılabilir.
>5. İmmünofloresan (IF) ile viral olarak enfekte olmuş hücrelerin tespiti
- Etanolü plakadan çıkarın.
- Tüm kuyucukları 200 μL PBS ile yıkayın ve çıkarın.
- Tüm kuyucuklara 200 μL PBS ekleyin ve 5 dakika inkübe edin.
- Bu arada, PBS'de birincil antikor seyreltmesini hazırlayın.
- Kuyucuk başına 100 μL 1:2000 fare monoklonal anti-IE gerekecektir (seyreltmenin malzemelerde listelenen spesifik antikor için olduğuna dikkat edin).
NOT: IF için kullanılan antikorun seyreltilmesi, bir alternatif kullanılıyorsa optimize edilmesi gerekebilir.
- Yeterli karışımı sağlamak için vorteks karışımı.
- PBS'yi tüm kuyucuklardan çıkarın ve 100 μL primer antikor seyreltmesi ekleyin.
- Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
- Primer antikoru tüm kuyucuklardan çıkarın.
- 200 μL PBS ekleyin ve 5 dakika inkübe edin.
- Bu arada, PBS'de ikincil antikor ve 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) seyreltmesini hazırlayın.
- Kuyucuk başına 100 μL 1:2000 florofor konjuge anti-Fare IgG ve 1 μg/mL DAPI gerekecektir.
- NOT: IF için kullanılan ikincil antikorun seyreltilmesi, bir alternatif kullanılıyorsa optimize edilmesi gerekebilir.
- Yeterli karışımı sağlamak için vorteks karışımı.
- PBS'yi tüm kuyucuklardan çıkarın ve 100 μL ikincil antikor / DAPI seyreltmesi ekleyin.
- Plakayı oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin, ışıktan koruyun.
- İkincil antikoru / DAPI'yi tüm kuyucuklardan çıkarın.
- Tüm kuyucukları 200 μL PBS ile yıkayın ve çıkarın.
- Tüm kuyucuklara 200 μL PBS ekleyin ve 5 dakika inkübe edin.
- PBS'yi çıkarın ve tüm kuyucuklara 100 μL PBS ekleyin ve ışıktan koruyarak görüntü için hazır olana kadar 4 °C'de saklayın.
not: Plakalar, sinyal/görüntü kalitesinde minimum kayıpla bir aya kadar saklanabilir.
6. Enfekte hücrelerin görüntülenmesi ve sayımı
- Enfeksiyonu kolay ve doğru bir şekilde ölçmek için, hem mavi (DAPI, çekirdek) hem de ikincil antikor (HCMV anında-erken proteinler (IE)) kanallarında her bir kuyucuğun en az% 25'ini görüntüleyin.
not: IE immünofloresan tarafından üretilen sinyal, nükleer boyamanınkine benzer olmalı ve bunu doğrulamak için görüntüler kontrol edilmelidir.
- Bu manuel olarak yapılabilir, ancak otomatik bir mikroskop kullanılması tavsiye edilir.
not: Büyütme cihazınıza bağlı olacaktır, ancak büyük yapılar (çekirdekler) görüntülendiğinden, 4X/10X objektifler genellikle yeterlidir.
- Görüntüler elde edildikten sonra, bunları tercih edilen yazılım analiz programı aracılığıyla işleyin.
- İlk olarak, mevcut hücre sayısını hesaplamak için mavi kanal aracılığıyla çekirdekleri tanımlayın.
- Enfekte olmuş hücrelerin sayısını hesaplamak için IE nükleer lokalize bir protein olduğundan, yalnızca bu alanların kırmızı kanaldaki sinyal için kontrol edilmesi gerekir.
- Enfekte hücre sayısı ve toplam hücre sayısı hesaplandıktan sonra, kuyu başına enfeksiyon yüzdesini hesaplayın.
- Bu değerler, enfekte olmamış kuyularda gözlemlenen ortalama enfeksiyon yüzdesini diğer tüm kuyulardan çıkararak arka plan tespit seviyeleri için düzeltilebilir.
not: Bu% 1'in çok altında olmalıdır. % 1'den fazla ise, analiz prosedürü optimizasyon gerektirir.
- Bu arka plan düzeltmeli değerler artık istenildiği gibi çizilebilir, sorgulanabilir ve analiz edilebilir.